宋春華,王爽,楊龍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.哈爾濱市中醫(yī)院,黑龍江 150000)

隨著世界人口老齡化程度的加劇,缺血性心血管疾病的發(fā)生率逐年增長,它對人類健康的嚴重危害已引起國內(nèi)外醫(yī)學工作者的高度重視。對于易患病的高危人群的未病先防是減輕本病危害程度的一個積極有效的手段,所以探索和尋找預(yù)防缺血性心血管疾病的有效手段成為國內(nèi)外醫(yī)學研究的熱點和重點。中醫(yī)學歷來注重對疾病的預(yù)防,而針刺又是預(yù)防疾病發(fā)生的重要手段之一。針刺通過刺激人體經(jīng)絡(luò)和腧穴,調(diào)整人體經(jīng)絡(luò)臟腑氣血的功能,從而達到預(yù)防疾病目的。針刺可以調(diào)動機體的潛能,啟動機體內(nèi)源性保護機制,提高機體自身內(nèi)在抗病與應(yīng)變能力,而不引起組織器官的損傷或機體功能代謝障礙等副反應(yīng)。本實驗觀察電針預(yù)處理心俞穴對心肌缺血再灌注損傷大鼠的影響,進一步探討電針預(yù)處理的心肌保護機制,為針灸理論在臨床的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

清潔級雄性 Wistar大鼠,體重(250±20)g。實驗儀器包括超凈工作臺、天平、生物組織包埋機、輪轉(zhuǎn)切片機、電熱恒溫箱、恒溫冰箱、光鏡、數(shù)碼像機、病理圖像分析系統(tǒng)軟件、紫外分光光度計、低速大容量離心機、小動物呼吸機、自動分析心電圖機。試劑采用硝酸還原法NO試劑盒、可見光法CAT試劑盒。

1.2 動物分組

40只健康Wistar雄性大鼠,隨機分為正常對照組(常規(guī)飼養(yǎng),不予任何處置)、模型組(開胸后缺血20 min,再灌注 40 min)、對照組(開胸后缺血 5 min再灌注5 min,反復3次,共30 min,余同模型組)、電針預(yù)處理組(電針 14 d,每日 1次,每次針刺后通電30 min,余同模型組),每組10只。電針預(yù)處理組24 h后進行缺血然后取材。

1.3 模型制備

采用在體心肌缺血再灌注損傷模型[1]。用10%烏拉坦腹腔注射麻醉,麻醉成功后仰臥位固定,除毛,消毒術(shù)區(qū),鋪無菌孔巾。沿頸部正中剪一長約2.5 cm切口,用眼科鑷子分離肌肉組織,暴露氣管,并分離。進行氣管插管,連接動物人工呼吸機,按 1～1.5 mL/ 100 g潮氣量,70～80次/min的頻率給予呼氣末持續(xù)正壓呼吸,呼吸比為 2:1,根據(jù)呼吸頻率及深度調(diào)整呼吸參數(shù)。沿胸骨左緣外約0.5 cm處剪斷第3、4肋骨,用線牽拉兩側(cè)剪斷的肋骨,暴露胸腔。小心破心包膜,用小棉球?qū)⑿叵偌白笮亩p輕向上推開,在冠狀動脈左前降支根部上中約1/3處穿一根0號醫(yī)用縫合線,經(jīng)線兩端穿一根聚乙烯小管以形成閉環(huán),拉緊閉環(huán)即壓迫左冠狀動脈前降支,產(chǎn)生缺血,放松閉環(huán)即出現(xiàn)再灌注,以左室前壁發(fā)紺并向外膨脹為缺血標志[2],同時心電在缺血時出現(xiàn)ST段抬高變寬,再灌注時出現(xiàn)恢復。

1.4 電針取穴與方法

穴位選擇參照華興邦大鼠穴位圖譜,于第 5胸椎棘突下旁開7 mm取心俞(雙)。雙側(cè)心俞穴直刺6 mm,連接KWD-808Ⅱ型全能脈沖電療儀,頻率為1 Hz,電壓為0.1 V,強度以肢體輕微顫動為度,時間30 min,每日1次,共針刺14 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 心電圖記錄

啟動心電圖機,設(shè)置相應(yīng)參數(shù),速度均為25.00 ms/div。毫針刺大鼠右上肢、左右下肢皮下,連接相應(yīng)導聯(lián)記錄心電圖,共記錄1 h。

1.5.2 血清中NO、CAT含量測定

摘取眼球采血,離心,取上清,采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的硝酸還原酶法一氧化氮(NO)試劑盒,測定血清中NO含量。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的可見光法過氧化氫酶(CAT)試劑盒,測定血清中CAT含量。

1.5.3 HE染色光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學變化

實驗結(jié)束后各組隨機取大鼠,剪下心臟后將其迅速放入含有1/1000DEPC的4%多聚甲醛0.1M PBS固定液中固定,取相同左心室缺血的心肌部位,室溫下經(jīng)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,備用。石蠟切片厚度為5m,裱于干凈載玻片上,60℃烘箱中烤片4 h→二甲苯脫蠟2次,每次 15 min→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇→蒸餾水蘇木素染胞核10 min→10%鹽酸乙醇分化→自來水沖 15 min(反藍)→蒸餾水Ⅰ→蒸餾水Ⅱ→伊紅染胞漿→各級乙醇脫水→二甲苯透明→樹脂膠封片→光鏡下觀察心肌細胞組織形態(tài)學變化。

1.6 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,組間比較應(yīng)用單因素方差分析,各實驗組間的兩兩比較采用q檢驗,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中NO含量

由表1可見,正常對照組大鼠血清中NO含量低于模型組(P＜0.01),模型組顯著低于對照組(P＜0.05),電針預(yù)處理組顯著高于模型組(P＜0.01),電針預(yù)處理組和對照組中 NO含量無明顯差別(P＞0.05),說明電針預(yù)處理可以提高大鼠血清中NO含量。

表1 各組大鼠血清中NO含量 (s,ol/L)

表1 各組大鼠血清中NO含量 (s,ol/L)

注:與正常對照組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 n NO含量正常對照組 10 46.06±2.52模型組 10 55.95±1.461)對照組 10 73.65±1.802)電針預(yù)處理組 10 74.60±1.793)

2.2 各組血清中CAT含量

由表2可見,正常對照組大鼠血清中CAT含量高于模型組(P＜0.01),模型組顯著低于對照組(P＜0.05),電針預(yù)處理組顯著高于模型組(P＜0.01),電針預(yù)處理組和對照組中CAT含量無明顯差別(P＞0.05),說明電針預(yù)處理可以提高大鼠血清中CAT含量。

表2 各組大鼠血清中CAT含量 (s,u/L)

表2 各組大鼠血清中CAT含量 (s,u/L)

注:與正常對照組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 n CAT含量

2.3 各組HE染色光鏡下觀察結(jié)果

正常對照組心肌纖維無變化,心肌細胞排列整齊緊密,形態(tài)完整,胞漿豐富,胞核飽滿,核仁深染、清晰(見圖1-A)。模型組有明顯組織損傷,組織間存在大量炎細胞浸潤,細胞腫脹明顯,細胞邊界模糊,多數(shù)細胞核固縮,核仁欠清晰,毛細血管腫脹明顯(見圖 1-B)。對照組與模型組比較,病變較輕。僅見少量炎細胞和腫脹細胞,細胞核及胞漿結(jié)構(gòu)如常,毛細血管腫脹輕微,細胞邊界較清晰,可見核仁(見圖1-C)。電針預(yù)處理組細胞腫脹輕微,毛細血管輕度充血、水腫,有少量胞界模糊的心肌細胞(見圖1-D)。

圖1 各組HE染色光鏡下觀察結(jié)果

3 討論

3.1 電針預(yù)處理對心肌組織形態(tài)學的影響

心肌組織耗氧量極大,并且代謝旺盛,幾乎沒有能量儲備,故而對心肌缺血極為敏感。本實驗通過對冠狀動脈左前降支根部上中約 1/3處進行結(jié)扎,模擬出心肌缺血以觀察心肌組織形態(tài)學變化。光鏡下顯示,缺血后的心肌纖維被嚴重破壞,表現(xiàn)為腫脹,邊界模糊,核仁不清晰,其毛細血管擴張充血,并存在大量的炎性細胞。該病理變化提示模型制備成功。對照組較模型組病變較輕,可見缺血預(yù)處理對心肌缺血存在耐受作用。對照組僅見少量炎性細胞,其心肌纖維排列整齊,細胞核及胞漿結(jié)構(gòu)正常。電針預(yù)處理組與對照組的形態(tài)學變化相似。光鏡下顯示為纖維輕微的腫脹,組織間僅有少量炎性浸潤,說明電針預(yù)處理對心肌存在保護作用,這不僅僅提高了心肌組織對缺血的耐受,而且還減輕其因缺血帶來的損傷,達到預(yù)期效果。

3.2 NO在心肌缺血過程中的作用

研究表明 NO具有舒張血管的作用[3-6],NO含量增加,K＋電導增強,細胞內(nèi) Ca2＋含量增加,從而激活NOS,NO與SGL上的Fe2＋結(jié)合SGC,空間結(jié)構(gòu)變化,細胞內(nèi)cGMP含量也增加,激活依賴于cGMP的蛋白激酶抑制蛋白激酶磷酸化,肌球蛋白輕鏈去磷酸化,細胞內(nèi)Ca2＋下降,收縮蛋白對Ca2＋敏感性下降,肌細胞上K＋通道活性下降,血管舒張。研究發(fā)現(xiàn)在IPC過程中主要涉及的是eNOS和iNOS,IPC的早期主要是Ca2＋依賴型的eNOS的活性增強,合成的 NO可驅(qū)動 EP相,晚期主要是非Ca2＋依賴型的iNOS的誘導激活其產(chǎn)生的NO與驅(qū)動IPC的DP相有關(guān)。近幾年的研究多認為iNOS在DP相中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此只要通過觀察NO含量變化就可以研究缺血性疾病的機制,有研究表明針刺可降低一氧化氮水平[7,8]。

在本實驗研究過程中,電針預(yù)處理組的大鼠血清中NO含量與缺血再灌注模型組相比有了明顯增多。這一研究不僅證實了該動物模型是成功的,還說明預(yù)先電針可以顯著提高大鼠血清中NO含量,以減輕心肌缺血再灌注對大鼠心肌組織的損傷。這表明預(yù)先電針可在心肌缺血時發(fā)揮一定的心肌保護作用。

3.3 CAT在心肌缺血過程中的作用

心肌缺血再灌注時氧自由基損傷起了主要作用,過氧化氫酶[9](CAT)主要同細胞內(nèi)線粒體與過氧體結(jié)合,能迅速分解細胞代謝中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)——H2O2,進而減少自由基的生成。它和超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)構(gòu)成人體重要的抗氧化酶系統(tǒng),三者協(xié)同作用以減少活性氧基的產(chǎn)生,防止脂質(zhì)過氧化及其中間代謝產(chǎn)物對機體的損害,具有十分重要的生理功能。CAT是清除H2O2的主要酶,因此測定CAT活性是了解機體自由基清除酶活性的重要手段之一。CAT以及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHps),這些酶能及時將體內(nèi)過剩的氧自由基(oxygen derived free radical, ODFR)還原成水而被清除,但是當ODFR的產(chǎn)生量超過了其清除能力時就會引發(fā)自由基損傷[10]。

由此可見,采用何種方法來提高心肌細胞抗氧化自由基損傷能力是防治心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。在實驗中,電針預(yù)處理組的大鼠血清中 CAT含量明顯增多,表明電針具有提高心肌細胞抗氧化自由基損傷的能力,能夠防治或減輕心肌缺血再灌注所造成的損傷?？梢婎A(yù)先電針在心肌缺血時能發(fā)揮一定的心肌保護作用。

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