王曉天，宋永勝，崔軍

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二泌尿外科，沈陽(yáng) 1 1 0 0 0 4）

近年來(lái)對(duì)于膀胱癌的病因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了多項(xiàng)研究，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變被認(rèn)為是主要的分子機(jī)制，其中表觀遺傳學(xué)的改變尤其是DNA甲基化近來(lái)研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明［1］，膀胱尿路上皮細(xì)胞癌組織中有多種相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化改變，其中某些抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展起重要作用，而基因啟動(dòng)子區(qū)胞嘧啶-磷酸-鳥苷（cytosine phosphate guanosine，CpG）島甲基化是抑癌基因失活的重要機(jī)制。

包含氧化還原酶的WW結(jié)構(gòu)域（WW domain containing oxidoreductase，WWOX）是一個(gè)新的抑癌基因，其表達(dá)缺失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于膀胱癌組織中WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化檢測(cè)還少見報(bào)道。本研究采用MSP檢測(cè)了膀胱癌組織中WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，并檢測(cè)WWOXmRNA的表達(dá)情況，了解WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)缺失之間的關(guān)系，探討WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，為確定膀胱癌的發(fā)病機(jī)制和早期生物學(xué)診斷指標(biāo)提供理論依據(jù)，為基因治療尋找新的靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集：收集2009年1月至2011年1月本院泌尿外科手術(shù)切除的54例膀胱癌患者的癌組織（病理證實(shí)均為膀胱移行細(xì)胞癌）及相應(yīng)的癌旁正常組織（距腫瘤切緣≥5 cm）。其中男38例，女16例；年齡 37～76歲，平均年齡（58.75±10.12）歲。膀胱癌組織標(biāo)本按WHO 2004年病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤18例，尿路上皮癌低級(jí)別25例，尿路上皮癌高級(jí)別11例；按UICC-TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：非浸潤(rùn)性膀胱癌（Ta～T1）36例，浸潤(rùn)性膀胱癌（T2～T3）18例。組織標(biāo)本切除后立即于液氮中速凍，2 h后轉(zhuǎn)置于-80℃冰箱中保存。所有膀胱癌患者均為初發(fā)，術(shù)前均未行放療、化療及免疫治療。所有組織標(biāo)本均經(jīng)我院病理科有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師證實(shí)并有完整的臨床資料，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器：DNA提取試劑盒（Gentra公司，美國(guó)），RNA提取試劑盒及Trizol（Sigma公司，美國(guó)），TIANScript RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN公司，北京），Real Master Mix（TIANGEN公司，北京），EZ DNA甲基化試劑盒（ZYMO RESEARCH公司，北京），Taq PCR Master Mix（TIANGEN 公司，北京）。NANO 2000紫外分光光度計(jì)（Thermo公司，美國(guó)），Exicycler 96熒光定量PCR儀（BIONEER公司，韓國(guó)），Life Express PCR儀（BIOER公司，杭州），DYY-7C電泳儀（六一公司，北京），WD-9413B凝膠成像分析儀（六一公司，北京）。MSP引物及realtime RT-PCR引物均由生工生物工程（上海）有限公司鑒定合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA和RNA提取按提取試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行，分別對(duì)膀胱癌組織和癌旁正常組織提取總DNA和RNA，提取核酸用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，符合純度要求的核酸立即進(jìn)行試驗(yàn)或置于-20℃保存待用。

1.2.2 MSP檢測(cè)膀胱癌組織及癌旁正常組織WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化情況按照EZ DNA甲基化試劑盒說(shuō)明書處理已提取的DNA樣品，對(duì)轉(zhuǎn)化后的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL：修飾后的DNA模板1 μL，上下游引物各 1 μL，2×Taq PCR Master-mix 10 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min后，95℃變性 1 min，58℃退火 60 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)含有溴化乙啶1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像分析儀進(jìn)行分析。DNA甲基化狀況的判斷：根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳分為（1）甲基化陽(yáng)性：只要是甲基化特異性引物擴(kuò)增為陽(yáng)性的即為甲基化陽(yáng)性；（2）非甲基化陽(yáng)性：非甲基化特異性引物擴(kuò)增陽(yáng)性的即為非甲基化陽(yáng)性。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)WWOX基因在膀胱癌組織及癌旁正常組織mRNA的表達(dá)：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將已提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，引物序列見表 1?？偡磻?yīng)體系為 20 μL：cDNA 模板 1 μL，上下游引物各 0.5 μL，SYBR GREEN Master-mix 10 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min后，95℃變性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后4℃再延伸5 min。由PCR曲線得到到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值，以 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用 2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 引物序列及產(chǎn)物片段長(zhǎng)度T a b.1 MS Pa n d r e a l-t i me P C Rp r i me r s f o r WWO X

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以x±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；組間計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法；相關(guān)關(guān)系分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析

經(jīng)MSP法對(duì)WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示54例膀胱癌組織中19例存在WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化（35.2%），54例癌旁正常組織中僅發(fā)現(xiàn)4例存在WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化（7.4%），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.43，P<0.05）。部分電泳結(jié)果見圖1。1號(hào)及2號(hào)標(biāo)本：癌組織（1C、2C）甲基化特異性引物擴(kuò)增為陽(yáng)性，對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（1N、2N）非甲基化特異性引物擴(kuò)增為陽(yáng)性；3號(hào)標(biāo)本：癌組織（3C）甲基化特異性引物擴(kuò)增及非甲基化特異性引物擴(kuò)增均為陽(yáng)性，對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（3N）非甲基化特異性引標(biāo)增為陽(yáng)性；4號(hào)標(biāo)本：癌組織（4C）非甲基化特異性引物擴(kuò)增為陽(yáng)性，對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（4N）非甲基化特異性引物擴(kuò)增為陽(yáng)性。

2.2 WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系

54例膀胱癌組織中WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)根據(jù)臨床病例特征分組，發(fā)現(xiàn)基因WWOX隨著癌組織分級(jí)的增加，啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率逐漸升高（5.6%、36.0%、81.8%），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）；而與臨床分期、性別、年齡、腫瘤直徑等臨床特征均無(wú)明顯相關(guān)性（P均>0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 膀胱癌WWO X基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系T a b.2 T h e r e l a t i o n b e t w e e nWWO Xme t h y l a t i o n a n d c l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s

2.3WWOXmRNA的表達(dá)分析

Real-time RT-PCR擴(kuò)增曲線及溶解曲線見圖2，圖 3。運(yùn)用 2-△△Ct法計(jì)算，WWOXmRNA 在膀胱癌組織中的平均表達(dá)量為（0.93±0.09），明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的平均表達(dá)量（1.10±0.08），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.73，P<0.05）。同時(shí)，啟動(dòng)子區(qū)甲基化的膀胱癌組織的WWOXmRNA表達(dá)量為（0.83±0.75），啟動(dòng)子區(qū)非甲基化的膀胱癌組織的WWOXmRNA 表達(dá)量為（0.99±0.47），啟動(dòng)子區(qū)甲基化組對(duì)WWOXmRNA的表達(dá)下調(diào)的影響要高于啟動(dòng)子區(qū)非甲基化組（t=9.46，P<0.05）。

2.4WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與WWOXmRNA表達(dá)的關(guān)系

膀胱癌組織中WWOXmRNA表達(dá)量與對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中表達(dá)量的比值小于0.5則定義為癌組織中WWOXmRNA低表達(dá)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在WWOXmRNA低表達(dá)的26例膀胱癌組織中，有53.8%（14/26）伴隨啟動(dòng)子區(qū)甲基化，28例WWOX mRNA非低表達(dá)的膀胱癌組織中5例發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)甲基化，說(shuō)明WWOXmRNA表達(dá)水平與WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)密切相關(guān)（r=0.377，P<0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

3 討論

WWOX基因是2000年由Bednarek等［3］應(yīng)用鳥槍基因測(cè)序技術(shù)結(jié)合對(duì)感興趣區(qū)域?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄子行分離并分析的方法鑒定出的一個(gè)新基因，位于常染色體16q23.3-q24.1區(qū)域，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，編碼一個(gè)長(zhǎng)為414個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量46 000 Da的單鏈蛋白。Yang等［4］研究發(fā)現(xiàn)，WWOX蛋白主要位于線粒體，在凋亡應(yīng)激因素的作用下，WWOX蛋白合成增加，第一個(gè)WW結(jié)構(gòu)域中的Try33發(fā)生磷酸化，線粒體通透性改變，進(jìn)而WWOX蛋白從線粒體轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，上調(diào)促凋亡因子P53，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2及Bcl-X1，從而增強(qiáng)TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；同時(shí)增強(qiáng)TRADD介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。WWOX蛋白與P53同為促凋亡蛋白，在介導(dǎo)凋亡中發(fā)揮協(xié)同作用，且WWOX基因是P53介導(dǎo)凋亡必不可少的配偶體［5］。因此認(rèn)為WWOX是一個(gè)新的抑癌基因，在多種腫瘤中的啟動(dòng)和進(jìn)展階段起重要作用。

細(xì)胞癌基因的激活和抑癌基因的失活是近年來(lái)腫瘤研究中的熱點(diǎn)，其中抑癌基因的失活被認(rèn)為是重要的致癌因素。膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素參與的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，其中涉及到許多癌基因及抑癌基因的變化，但具體調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。研究表明［6］，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而調(diào)控基因的表達(dá)，是表觀遺傳學(xué)重要的修飾方式，而甲基化主要發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)域的 CpG 島。最新多項(xiàng)研究指出［7，8］，WWOX 基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化與某些腫瘤的臨床分期和病理類型相關(guān)，成為腫瘤分子診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。

表3WWO X基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與WWO XmR N A表達(dá)的相關(guān)性T a b.3 T h e r e l e v a n c e b e t w e e nWWO Xme t h y l a t i o n a n d t h e mR N Ae x p r e s s i o n

本研究采用MSP和real-time RT-PCR方法檢測(cè)了54例膀胱癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中WWOX啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示膀胱癌組織中啟動(dòng)子區(qū)甲基化率顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，說(shuō)明WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化可能參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WWOXmRNA在膀胱癌組織中的平均表達(dá)量明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織，而且在54例膀胱癌組織中，發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)甲基化的19例癌組織WWOXmRNA表達(dá)量低于啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)生甲基化的35例膀胱癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示W(wǎng)WOX基因的表達(dá)缺失與膀胱癌的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)，WWOX啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化是導(dǎo)致膀胱癌組織WWOXmRNA轉(zhuǎn)錄受阻的原因之一。在分析WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與WWOXmRNA表達(dá)的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中73.7%（14/19）的基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化的膀胱癌組織中，同時(shí)也存在WWOX mRNA表達(dá)下調(diào)；而在26例WWOXmRNA表達(dá)下調(diào)的癌組織中，有12例未發(fā)現(xiàn)WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，表明膀胱癌組織中WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化并不是使基因表達(dá)改變的唯一原因，同時(shí)還可能存在WWOX基因突變、雜合性缺失等機(jī)制引起該基因表達(dá)下調(diào)或缺失，還有可能是由于在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域以外的其他CpG島也存在甲基化現(xiàn)象，同樣引起該基因表達(dá)下調(diào)或缺失。本研究中WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與患者性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期等無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），而與膀胱腫瘤的病理學(xué)分級(jí)有明顯關(guān)聯(lián)（P<0.05）。高級(jí)別尿路上皮癌組織中基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率（81.8%）高于低級(jí)別尿路上皮癌組織（36.0%），后者又高于低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤組織（5.6%），結(jié)果提示：WWOX基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化改變可以提示膀胱腫瘤細(xì)胞的潛在侵襲性，在膀胱移行細(xì)胞癌的早期發(fā)生及發(fā)展中有重要作用，并且可能成為診斷膀胱移行細(xì)胞癌的早期診斷指標(biāo)。

Chung等［9］研究表明，膀胱癌患者血液、尿液中的基因甲基化水平和其對(duì)應(yīng)的膀胱癌組織中的基因甲基化水平具有很好的相關(guān)性，另外，膀胱癌的發(fā)病是一個(gè)多基因決定的綜合事件。因此，可以將WWOX與其他多種在膀胱癌中高頻甲基化的基因組合為膀胱癌的DNA甲基化譜，進(jìn)行血液、尿液樣本的DNA甲基化譜檢測(cè)，將為膀胱癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供一種新的、無(wú)創(chuàng)性的手段［10］。

DNA甲基化是一種可逆性變化，因此逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化狀態(tài)，恢復(fù)其正常表達(dá)及功能可能成為膀胱癌基因治療的新方法。目前已有研究［11］采用甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷或其衍生物體外處理抑癌基因甲基化而失活的腫瘤細(xì)胞，可以使啟動(dòng)子區(qū)DNA去甲基化，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞抑癌基因的表達(dá)。因此，更深入地研究腫瘤表觀遺傳學(xué)有望在基因表達(dá)調(diào)控和膀胱癌發(fā)生發(fā)展上獲得新的突破，并可能提出新的治療靶點(diǎn)。

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