葉 煒，田呂明，姚 鵑，趙 劼，楊海珍，呂育財(cái)，肖 貝，龔大春，*

（1.三峽大學(xué)-艾能麥克德?tīng)柮椎略偕茉磳?shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443002）

AMP脫氨酶的生化性質(zhì)研究

葉 煒1，田呂明1，姚 鵑2，趙 劼2，楊海珍2，呂育財(cái)1，肖 貝1，龔大春1，*

（1.三峽大學(xué)-艾能麥克德?tīng)柮椎略偕茉磳?shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443002）

主要從底物濃度、溫度、pH和常見(jiàn)離子等方面對(duì)相對(duì)分子量56ku左右的腺苷酸脫氨酶的催化作用的影響因素進(jìn)行研究。通過(guò)酶的催化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：原始底物質(zhì)量濃度為2.78×10-2g/L、溫度為37℃、pH為5.9時(shí)，AMP脫氨酶催化活性最好，IMP的轉(zhuǎn)化速度最高為1.965×10-2mol/min。同時(shí)考察了Cu2+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Na+、Mg2+、Zn2+等陽(yáng)離子和SO42-、Cl-、NO3-、CO32-、H2PO4-、B4O72-、檸檬酸根、EDTA離子等陰離子對(duì)AMP脫氨酶催化能力的影響。結(jié)果表明：檸檬酸根離子和Mn2+對(duì)AMP脫氨酶有明顯激活性影響，其他離子濃度超過(guò)0.01mol/L時(shí)對(duì)AMP脫氨酶一般有抑制性影響，AMP脫氨酶商品酶在常溫干燥狀態(tài)下穩(wěn)定性很好，4℃存放的酶液半衰期為5.5d。

AMP脫氨酶，酶活，生化性質(zhì)

腺苷酸脫氨酶（AMP deaminase，EC 3.5.4.6）最早由鼠骨骼?。–onway，1939）隨后又由人紅血細(xì)胞（Chaney，1962）制備，目前工業(yè)中通過(guò)培養(yǎng)酵母、青霉、曲霉和毛霉發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶[1]。脫氨酶是構(gòu)成嘌呤核苷酸代謝循環(huán)的三種主要酶類(lèi)之一，通過(guò)凝膠過(guò)濾測(cè)定相對(duì)分子量為48000±2000，通過(guò)SDSPAGE測(cè)定時(shí)相對(duì)分子量為60000±3000，屬于疏基酶，每分子含2個(gè)活性疏基，其活性能對(duì)氯汞甲酸完全抑制，能催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷，再經(jīng)核苷磷酸化酶作用生成次黃嘌呤，其代謝緩和終末產(chǎn)物為尿酸[2]。AMP脫氨酶是一種氨基水解酶，它能夠定量脫去腺苷酸嘌呤堿基上的氨基，生成IMP和NH3[3]，在食品添加劑上，脫氨酶最大用途是酶解腺苷酸生成IMP用于生產(chǎn)強(qiáng)力味精，它還是核酸酶解法生產(chǎn)呈味核苷酸的重要酶類(lèi)之一，在酵母提取物的制備中，一般用核酸酶和AMP脫氨酶來(lái)增強(qiáng)味道[4]。其他產(chǎn)業(yè)上，脫氨酶用于生產(chǎn)細(xì)胞的H+緩沖劑。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)AMP脫氨酶性質(zhì)的研究，只有劉軍昌[5]對(duì)來(lái)源于米曲霉的脫氨酶pH、熱穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)在30℃和pH6的時(shí)候酶穩(wěn)定性較好。Kazuki yoshimune[4]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于煙曲霉的脫氨酶相對(duì)分子量為88ku，最適反應(yīng)溫度為50℃左右及pH為6時(shí)酶活力最高，也考察了金屬離子的影響。本文用已知AMP脫氨酶酶活的商品酶進(jìn)行脫氨酶生化特性的研究，深入了解AMP脫氨酶的催化性質(zhì)，有利于高核酸酵母的進(jìn)一步發(fā)展，為增加酵母提取物IMP含量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

5’-AMP 上海楷洋生物技術(shù)有限公司；腺苷酸脫氨酶商品酶（酶活為16000u/g） 安琪公司提供；其他試劑 均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活測(cè)定[5]液態(tài)酶酶活測(cè)定：移取3mL反應(yīng)底物（3.475×10-2g/L）在37℃溫度下保溫5min，加入稀釋后的AMP脫氨酶溶液0.1mL，立刻計(jì)時(shí)反應(yīng)，反應(yīng)15min后加入3mL 10%的高氯酸溶液終止反應(yīng)。

對(duì)照樣品方法同上，反應(yīng)底物保溫后用冰水預(yù)冷，加入3mL10%的高氯酸溶液終止反應(yīng)，再加入0.1mL的樣品。反應(yīng)結(jié)束后，在265nm處，用石英比色皿，以水為參比測(cè)量吸光度。

酶活定義：在上述條件下每分鐘吸光值改變0.001，定義為酶的活力單位。

測(cè)定固態(tài)酶酶活時(shí)稱(chēng)取m（g）固態(tài)酶，溶解在1mL溶液中，然后按照上述方法測(cè)定。兩種不同狀態(tài)酶的酶活計(jì)算公式如下：

液體酶活（u/mL）=（△A265×10×K）/（0.001×T）

固體酶酶活（u/g）=（△A265×10×K）/（0.001×T×m）

式中：△A265為空白對(duì)照與反應(yīng)液吸光度的差值；K為酶液稀釋倍數(shù)；T為酶的反應(yīng)時(shí)間（min）；m為固態(tài)酶的質(zhì)量（g）。

1.2.2 酶純度及分子量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) SDS-聚丙烯酰胺電泳，分離膠為12.5%，濃縮膠5%，pH8.3 Tris-甘氨酸電泳緩沖液，加樣量為20μL，電泳1.5～2h查看公司提供固態(tài)酶純度及具體分子量。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 底物質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取139mg腺苷酸，用0.08mol/L的NaHCO3溶液定容至10mL，即13.9g/L作為原始底物質(zhì)量濃度。把原始底物質(zhì)量濃度稀釋400～1000倍數(shù)，配制成3.475×10-2、2.78×10-2、2.317×10-2、1.986×10-2、1.738×10-2、1.544× 10-2g/L不同的質(zhì)量濃度梯度，在pH為6.0時(shí)，與質(zhì)量濃度0.01g/mL的酶在37℃反應(yīng)15min，測(cè)定△A265，計(jì)算反應(yīng)速度。

1.2.3.2 酶質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 配制0.008～0.025g/mL的質(zhì)量濃度范圍的商品酶，在底物濃度為3.475×10-2g/L，pH為6.0，37℃條件下反應(yīng)15min，測(cè)定△A265，計(jì)算反應(yīng)速度。

1.2.3.3 腺苷酸脫氨酶的最適反應(yīng)溫度實(shí)驗(yàn) 在27～62℃溫度范圍內(nèi)，添加0.01g/mL的酶，在底物濃度為3.475×10-2g/L，pH為6.0條件下反應(yīng)15min，測(cè)定△A265，計(jì)算反應(yīng)速度。

1.2.3.4 腺苷酸脫氨酶的最適反應(yīng)pH實(shí)驗(yàn) 在pH為4.5～7.5范圍內(nèi)，添加0.01g/mL的酶，在底物濃度為3.475×10-2g/L，37℃條件下反應(yīng)15min，測(cè)定△A265，計(jì)算反應(yīng)速度。

1.2.3.5 陰、陽(yáng)離子對(duì)腺苷酸脫氨酶活性的影響 在0.001～0.1mol/L范圍內(nèi)，配制不同離子梯度溶液，添加到脫氨酶反應(yīng)體系中，在底物濃度為3.475×10-2g/L，pH為6.0，37℃條件，反應(yīng)15min，測(cè)定相對(duì)酶活。考察陽(yáng)離子的影響時(shí)，陰離子均為硫酸根離子，主要有Cu2+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Na+、Mg2+、Zn2+，濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L五個(gè)梯度溶液；考察陰離子的影響時(shí)，陽(yáng)離子均為對(duì)酶活無(wú)影響的鈉離子，主要有SO42-、Cl-、NO3-、CO32-、H2PO4-、B4O72-、檸檬酸根、EDTA離子，濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L五個(gè)梯度溶液。

1.2.3.6 腺苷酸脫氨酶的穩(wěn)定性研究 固態(tài)穩(wěn)定性：將商品酶在常溫干燥狀態(tài)下存放，每周測(cè)一次酶活，經(jīng)過(guò)三個(gè)月比較相對(duì)酶活。酶液穩(wěn)定性：配制0.01g/mL酶液10mL，在4℃下存放每隔24h，測(cè)定酶活，比較相對(duì)酶活，考察酶的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺苷酸脫氨酶的鑒定、純度及相對(duì)分子量的檢測(cè)

采用不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠體積分?jǐn)?shù)為12.5%，濃縮膠為5%，當(dāng)溴酚蘭達(dá)凝膠下部2/3時(shí)（約2h）終止電泳。用考馬斯亮藍(lán)G-250染液染色3h，經(jīng)脫色液過(guò)夜洗脫，用紫外拍照成像如圖1所示。商品酶一共由4種蛋白組成，相對(duì)分子量從大到小分別為56、35、33、27ku，其中56ku的酶濃度較高。經(jīng)過(guò)與專(zhuān)利[6]所闡述的酶的相對(duì)分子量57ku相對(duì)照和AMP脫氨酶酶活實(shí)驗(yàn)，確定商品酶主要為AMP脫氨酶。該商品酶可以用于酶學(xué)生化性質(zhì)的研究。

圖1 AMP脫氨酶的商品酶SDS-PAGE電泳圖Fig.1 The AMP deaminase enzyme products by SDS-PAGE map

2.2 底物質(zhì)量濃度的影響

按照1.2.3.1的方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，在底物質(zhì)量濃度為2.317×10-2g/L以下，酶催化反應(yīng)速度與底物質(zhì)量濃度趨近正比關(guān)系，反應(yīng)速度隨著底物質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度在2.317×10-2～2.78×10-2g/L時(shí)，反應(yīng)速度上升并趨于穩(wěn)定。在底物質(zhì)量濃度為2.78×10-2g/L時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到最大，即為1.965×10-2mol/min；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)反應(yīng)速度下降，底物質(zhì)量濃度是決定酶催化反應(yīng)速度的主要因素。說(shuō)明底物濃度過(guò)高對(duì)脫氨酶的催化作用有一定抑制作用。

2.3 酶質(zhì)量濃度的影響

按照1.2.3.2的方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，酶的質(zhì)量濃度在小于0.013g/mL范圍內(nèi)遞增時(shí)，酶催化反應(yīng)速度與酶質(zhì)量濃度趨近成正比關(guān)系。當(dāng)酶質(zhì)量濃度超過(guò)0.013g/mL，酶催化速度隨濃度的增加而下降。脫氨酶反應(yīng)產(chǎn)物NH3和IMP對(duì)酶有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[5]，產(chǎn)物隨著酶質(zhì)量濃度的增加而增加，對(duì)酶的抑制作用加強(qiáng)，從而降低酶的反應(yīng)速度。

圖3 酶質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on reaction speed

2.4 溫度的影響

按照1.2.3.3的方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，在27～37℃之間，隨著溫度的上升，酶的反應(yīng)速度急劇上升，在37℃時(shí)，反應(yīng)速度到達(dá)最高為1.965× 10-2mol/min。隨溫度繼續(xù)上升，反應(yīng)速度急劇下降，但當(dāng)溫度上升到42℃時(shí)下降幅度變小，當(dāng)溫度超過(guò)52℃時(shí)，反應(yīng)速度又開(kāi)始快速下降。在其他條件相同的情況下，溫度每升高10℃，化學(xué)反應(yīng)速度增加將近一倍，當(dāng)溫度升高到37℃時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到最大。隨溫度繼續(xù)上升酶開(kāi)始變性失活，反應(yīng)速度快速下降，當(dāng)溫度上升到42℃，產(chǎn)物NH3游離態(tài)減少，降低對(duì)脫氨酶的抑制，反應(yīng)速度下降幅度平緩，但當(dāng)溫度超過(guò)52℃，腺苷酸脫氨酶嚴(yán)重變性失活，反應(yīng)速度又快速下降。為保證酶的有效利用，反應(yīng)溫度應(yīng)該控制為37℃。

圖4 溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響Fig.4 Effect of temperature on reaction speed

2.5 pH對(duì)腺苷酸脫氨酶反應(yīng)速度的影響

按照1.2.3.4的方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。由圖可知在pH為6以?xún)?nèi)，反應(yīng)速度隨pH的增加而增加，在pH為5.9時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到最大值，當(dāng)pH超過(guò)6以后，反應(yīng)速度隨pH的增加而下降。因此酶的最適pH為5.9左右，最適pH=（pK1+pK2）/2=（5.2+6.7）/2=5.95，基本上符合酶的最適pH。脫氨酶也是一種蛋白質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸含有堿性、中性、酸性基團(tuán)。在一定的pH范圍內(nèi)，酶既帶有正電荷基團(tuán)也帶有負(fù)電荷基團(tuán)，而這些基團(tuán)是構(gòu)成酶活性點(diǎn)的部分。一種酶只能在一種特定的電荷狀況下才具有催化活性。AMP脫氨酶也是這樣的，隨著pH的變化，具有這種特定電荷狀況的酶只占總酶的一部分，酶的反應(yīng)速度有個(gè)最大值，在最適pH條件下，酶反應(yīng)速度達(dá)到最大。在pH5.5～6.5時(shí)，酶相對(duì)穩(wěn)定，酶活在70%以上。

圖5 pH對(duì)AMP脫氨酶的影響Fig.5 Effect of pH on AMP deaminase

2.6 陽(yáng)離子對(duì)AMP脫氨酶活性的影響

按照1.2.3.5陽(yáng)離子考察方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可知，Cu2+在0.001mol/L對(duì)酶活有促進(jìn)作用，但當(dāng)濃度上升到0.005mol/L，開(kāi)始對(duì)酶有抑制作用。Mn2+在0.001～0.1mol/L對(duì)酶都有促進(jìn)作用。Al3+在0.01mol/L以?xún)?nèi)對(duì)酶活沒(méi)有影響，而超過(guò)這個(gè)濃度對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。Na+對(duì)酶活基本上沒(méi)有影響，其他離子在0.01mol/L以?xún)?nèi)對(duì)酶活影響不大，當(dāng)濃度超過(guò)0.01mol/L，對(duì)酶活都有一定的抑制作用。

圖6 陽(yáng)離子對(duì)AMP脫氨酶酶活的影響Fig.6 Effect of some cations on AMP deaminase

2.7 陰離子對(duì)AMP脫氨酶活性的影響

按照1.2.3.5陰離子考察方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖可知，檸檬酸-對(duì)AMP脫氨酶有明顯激活性影響，CO32-、EDTA-在0.01mol/L內(nèi)對(duì)酶活有促進(jìn)作用，而濃度的上升對(duì)酶活開(kāi)始有抑制作用。SO42-對(duì)酶活顯著影響，Cl-、NO3-、H2PO4-和B4O72-都對(duì)酶活有抑制作用，濃度超過(guò)0.01mol/L時(shí)抑制作用比較強(qiáng)烈。

圖7 陰離子對(duì)AMP脫氨酶酶活的影響Fig.7 Effect of anion on AMP deaminase

2.8 AMP脫氨酶的穩(wěn)定性研究

2.8.1 固態(tài)穩(wěn)定性 按照1.2.3.6方案實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8。由圖可知，由于脫氨酶很容易吸潮，商品酶在常溫干燥下存放3個(gè)月，相對(duì)酶活保持在90%以上，在這段時(shí)間無(wú)法通過(guò)半衰期或者90%遞減時(shí)間考察酶的穩(wěn)定性情況。只能肯定AMP脫氨酶商品酶在常溫干燥情況下有很好的穩(wěn)定性。AMP脫氨酶具有極易吸潮性，吸潮后有氧氣和水分，使疏基易被氧化，因而降低酶活。在常溫干燥條件下就能保證AMP脫氨酶酶活的穩(wěn)定。

圖8 存放時(shí)間對(duì)干燥商品酶酶活的影響Fig.8 Effect of dry goods storage time on the activity of the enzyme

圖9 4℃下的酶液存放時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.9 Effect of 4℃storage time on enzyme activity

2.8.2 液態(tài)穩(wěn)定性 按照1.2.3.6方案實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9。由圖可知，酶液在4℃下保存，相對(duì)酶活隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，從第4d開(kāi)始酶活急劇下降，到第7d酶活下降趨于平衡。由于AMP脫氨酶也是一種蛋白質(zhì)，可能因?yàn)樗肿訒?huì)引起酶分子中天冬酰胺和谷氨酰胺的脫氨基作用、還可能會(huì)引起天冬氨酸肽鍵的水解、半胱氨酸的氧化、二硫鍵的破壞等，所以，酶分子在水溶液中隨時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力下降。當(dāng)?shù)降?d時(shí)可能是由于酶變性接近完成，變性酶的含量大于未變性酶的含量很多，相對(duì)酶活下降趨于穩(wěn)定。由圖9中還可以看出，在4℃下AMP脫氨酶的半衰期為5.5d。

3 結(jié)論

隨著5’-AMP脫氨酶的研究與開(kāi)發(fā)，AMP脫氨酶被廣泛應(yīng)用于食品，醫(yī)學(xué)以及其他領(lǐng)域。本研究以AMP脫氨酶商品酶（酶活為16000u/g）為研究對(duì)象，采用SDS-PAGE電泳測(cè)得AMP脫氨酶的相對(duì)分子量約為56ku。結(jié)果表明：原始底物質(zhì)量濃度為2.78×10-2g/L、反應(yīng)溫度為37℃、pH為5.9時(shí)，AMP脫氨酶催化活性最好，IMP的轉(zhuǎn)化速度最高為1.965×10-2mol/min。不同離子對(duì)AMP脫氨酶酶活會(huì)產(chǎn)生不同的影響，研究表明：檸檬酸根離子和Mn2+對(duì)AMP脫氨酶都有激活性，當(dāng)激活劑的濃度低于0.05mol/L時(shí)，對(duì)脫氨酶有更強(qiáng)激活作用。不同濃度的Na+、SO42-對(duì)脫氨酶無(wú)明顯影響，其他離子濃度超過(guò)0.01mol/L對(duì)AMP脫氨酶一般都有抑制性影響。AMP脫氨酶商品酶在常溫干燥狀態(tài)下的穩(wěn)定性很好，4℃下酶液的半衰期為5.5d。為高核酸酵母抽提物的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

[1]普為民，丁驊孫，陶元器.5’-腺苷酸脫氨酶產(chǎn)生菌選育及發(fā)酵生態(tài)學(xué)研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，16（2）：184-188.

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Study on the biochemical characteristics of AMP deaminase

YE Wei1，TIAN Lv-ming1，YAO Juan2，ZHAO Jie2，YANG Hai-zhen2，LV Yu-cai1，XIAO Bei1，GONG Da-chun1，*
（1.Alan G.Macdiamid Institute of Renewable Energy，China Three Gorges University，Yichang 443002，China；2.Angel Yeast Co.Ltd.，Yichang 443002，China）

The effects of the substrate concentration，temperature，pH value，and the other common ion on the catalytic action of Adenosine Deaminase with about 56ku molecular weight were studied.The best catalytic conditions such as the substrate concentration 2.78×10-2g/L，temperature 37℃，and pH value 5.9 were obtained，which the highest catalytic conversion rate was 1.965×10-2mol/min.Meanwhile，Cu2+，F(xiàn)e2+，Al3+，Mn2+，Na+，Mg2+，Zn2+and SO42-，Cl-，NO3-，CO32-，H2PO4-，B4O72-，lemon acid radical，EDTA ion were found having a certain influence to the AMP deaminase.The result showed that lemon acid radical ion and Mn2+had an obviously activated influence on AMP deaminase，but the other ion concentration surpass 0.01mol/L generally had an inhibitory effect on AMP deaminase and the AMP deaminase powder had a good stability quality under atmospheric temperature in dry condition and the half-life of enzyme solution was 5.5 days at 4℃.

AMP deaminase；enzymatic activity；biochemical characteristics

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）01-0164-04

2010－11－30 *通訊聯(lián)系人

葉煒（1985-），男，碩士在讀，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化。

三峽大學(xué)2010年研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2010CX099）。