王 娟，王建勇，蘇 平，涂俊銘

(湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

藻膽蛋白主要存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)一些甲藻中 ,其主要功能是作為光合作用的捕光色素蛋白。已知的藻膽蛋白主要可以分為4大類 ,即藻紅蛋白(Phycoerythrin)、藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin)、藻紅藍(lán)蛋白(Phcoerycyanin)和異藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin)[1]。1928年，Lemberg首次證明藻膽蛋白是由脫輔基蛋白和通過一個或兩個硫醚鍵共價連接藻藍(lán)素(Phycocyanobilins,PCB)——一種開鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)組成的四吡咯結(jié)構(gòu)的色基所組成[2]，連接位點(diǎn)通常在α84(α亞基第 84位氨基酸)和β84(β亞基第84位氨基酸)等保守位點(diǎn)上[3]。由于藻膽蛋白與植物光敏素在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、組成以及光譜特征等方面均十分相似，而且在體外可以誘導(dǎo)藻膽蛋白具有類似于植物光敏素的光化學(xué)特征[4]。因此，推測藻膽蛋白與光敏素之間在功能上可能存在著某種關(guān)系，它們可能起源于同一祖先蛋白，在長期的進(jìn)化中兩者的功能發(fā)生改變，但在一定的條件下，藻膽蛋白可能會行使類似于植物光敏素的功能。

藻膽蛋白是種天然色素蛋白，具有較強(qiáng)熒光活性(發(fā)橙紅色熒光)，本身則呈紅色、紫色或藍(lán)色等，故被稱為有色多肽。藻膽蛋白的水溶性大，無毒性，色澤鮮艷，熒光明亮，具有抗氧化，增強(qiáng)免疫抑制腫瘤等多種生物活性，因此在食品、化妝品、臨床醫(yī)學(xué)診斷、免疫化學(xué)和生物工程等領(lǐng)域中具有廣闊潛在的應(yīng)用前景和研究開發(fā)價值。藻膽蛋白及其標(biāo)記物在國際上的售價相當(dāng)高，研究和開發(fā)藻膽蛋白在經(jīng)濟(jì)效益方面有很好的前景[5]；藻膽蛋白是種最具開發(fā)潛力的光敏劑，用于腫瘤的光動力治療，且在光合作用的原初理論方面具有重要的研究價值；藻膽蛋白的水溶液呈亮澤藍(lán)色，可望作為一種高營養(yǎng)天然色素應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域；利用藻膽蛋白的特殊熒光可作為熒光免疫檢測中的活性物質(zhì)等[6～8]。

由此可見，在科研實驗及工藝生產(chǎn)中對增加藻膽蛋白的表達(dá)量及提取純化等是十分有意義的，這能為后續(xù)實驗研究的正常有序進(jìn)行奠定條件基礎(chǔ)[9]。然而，在藻膽蛋白的研究上，國內(nèi)外大量報導(dǎo)的主要是集中在藻膽蛋白的提取、結(jié)構(gòu)、功能、基因工程、合成、應(yīng)用及生物活性研究等方面，卻在報道如何優(yōu)化藻膽蛋白表達(dá)條件的相對較少。據(jù)薛志欣[10]等報道，在波長565和620nm處測定藻膽蛋白(0～1.2mg/mL內(nèi))具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.9995，r=0.9998，該方法測定藻膽蛋白的回收率分別為99.07%和99.11%.與傳統(tǒng)的Lowry法相比，該方法測定蛋白簡便快速，重現(xiàn)性好,只要充分注意避光，加入PBS，用分光光度法來測定藻膽蛋白的含量是完全可行的。盡管不同方式提取的藻膽蛋白的吸收峰位置略有不同，但幾乎都有560nm左右的吸收峰[11，12]，所以，本實驗選用560nm作為藻紅蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)，用單因素實驗和正交實驗的研究方法，通過極差分析和方差分析來優(yōu)化藻膽蛋白表達(dá)的條件(溫度、誘導(dǎo)劑量和誘導(dǎo)時間)，從而希望能為實現(xiàn)藻膽蛋白科研乃至工藝生產(chǎn)規(guī)模化表達(dá)提取及其開發(fā)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 含有pACYCDuet-ho1-pcyA、pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA的E.coliBL21菌種，由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.2)

1.1.3 試劑與儀器 蛋白胨、酵母提取物為國產(chǎn)分析純，IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，Amp(氨芐青霉素)、Kan(卡那霉素)為國產(chǎn)分析純，Chl(氯霉素)為市售醫(yī)用。

UV-2102PC紫外可見光光度計(尤尼科儀器有限公司)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY92-Ⅱ(寧波新芝科儀研究所)、高速臺式離心機(jī)ROTINA35R(Hettich)、GL-20G-11型變速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 儲存液配制 超聲緩沖液(100mmol/L NaCl，0.2mol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.2)

Amp儲備液(用無菌二次重蒸水配成100mg/mL氨芐青霉素(ampicillin，簡稱Amp)溶液，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?

Kan儲備液(用無菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素(kanamycin，簡稱Kan)溶液，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?

氯霉素(Chl)儲備液(用無水乙醇配成34mg/mL氯霉素溶液，分裝，-20℃保存)

IPTG儲備液(將2g異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，簡稱IPTG)，溶于二次重蒸水中，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 菌種活化培養(yǎng)和表達(dá) 1) 菌種活化 挑取轉(zhuǎn)化單菌落接種于5mL含有目標(biāo)質(zhì)粒的抗生素(氯霉素17μg/mL、氨芐霉素25μg/mL、卡那霉素15μg/mL)的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

2) 擴(kuò)大培養(yǎng) 將活化后的菌液接種到50mL的LB培養(yǎng)液的三角瓶中，同時加入相應(yīng)的抗生素，放恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)。

3) 誘導(dǎo)表達(dá) 每隔1h測OD600，確保OD600在0.4～0.6之間后，將菌液置于冰水中放置半個小時，加入相應(yīng)的IPTG量，在相應(yīng)的溫度下進(jìn)行避光、過夜誘導(dǎo)。

1.2.3 蛋白提取 1) 將誘導(dǎo)后的菌液離心(5000rpm，5min)收集細(xì)胞，二次蒸餾水洗兩次。

2) 將洗好的細(xì)胞傾去上清液后，重懸于一定量的超聲緩沖液中，用超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞(220W，工作2s，間隔3s，超聲6min)，然后12000r/min離心15min，得上清稀釋定容為6mL備用。

1.2.4 蛋白含量測定及計算 取適量藻膽蛋白上清液，測定A568值依照公式：A=ξCL(其中：ξ藻膽蛋白在波長568nm處的摩爾吸光系數(shù)ξ568=96000M-1cm-1;[13]C蛋白上清液物質(zhì)的量濃度；L比色杯內(nèi)徑1cm)，求蛋白濃度。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 培養(yǎng)條件單因素實驗 據(jù)陳思禮[14]等報道，誘導(dǎo)藻膽蛋白表達(dá)的最適宜的IPTG終濃度為1.0mmol/L，細(xì)胞濃度應(yīng)控制OD600在0.4～0.6間(OD600為0.4和0.6分別處于細(xì)胞生長的對數(shù)早期和對數(shù)晚期，加入IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)入穩(wěn)定期進(jìn)行表達(dá)，對產(chǎn)物產(chǎn)量沒有較明顯的影響)，搖床速度為100r/min，因此在各單因素試驗中的上述條件相同。

試驗因素1：誘導(dǎo)溫度16℃、20℃、24℃、28℃、37℃，誘導(dǎo)時間12h.

試驗因素2：誘導(dǎo)時間6、8、10、12、14、16h，誘導(dǎo)溫度28℃(試驗因素1中得出)。

1.3.2 正交實驗 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，分別以誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度三個因素為影響因素，以藻膽蛋白表達(dá)含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗研究，以確定最佳表達(dá)條件參數(shù)，試驗方案如表1所示。

表1 藻膽蛋白表達(dá)的正交試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 誘導(dǎo)溫度對藻膽蛋白表達(dá)的影響 由不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)蛋白含量得到圖1，從圖1可以看出，誘導(dǎo)溫度在16℃和28℃時，藻膽蛋白表達(dá)率較高，在其他溫度條件下，藻膽蛋白產(chǎn)量下降非常明顯。誘導(dǎo)溫度在28℃時達(dá)到最大，為7.52lmg/100mL.出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能是因為，當(dāng)溫度為28℃時有利于該重組細(xì)胞的生長、蛋白的表達(dá)以及脫輔基蛋白與色素的耦合，而催化兩者耦合的酶可能在低溫16℃下的活性較高。結(jié)果說明，在其他條件相同的條件下，當(dāng)提高溫度，有利于細(xì)胞的表達(dá)，所以在該套表達(dá)重組體系中，28℃時蛋白與色素耦合在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)重組效果明顯好于其他溫度，28℃為表達(dá)重組的最適溫度。

圖1 誘導(dǎo)溫度對藻膽蛋白表達(dá)的影響

2.1.2 誘導(dǎo)時間對藻膽蛋白表達(dá)的影響 由不同誘導(dǎo)時間獲得蛋白含量得到圖2，從圖2中看出，在8h～14h誘導(dǎo)時間的區(qū)間內(nèi)，藻膽蛋白的表達(dá)量總體上升趨勢，在誘導(dǎo)時間8h時細(xì)胞表達(dá)量就已明顯較高，在12～14h區(qū)間內(nèi)的增加幅度最大，14h后則停止了增加或增長效果不明顯。從結(jié)果可以分析，誘導(dǎo)表達(dá)時間太短，蛋白表達(dá)不足，脫輔基蛋白和色素不能最大限度的進(jìn)行自催化重組；表達(dá)時間過長，體內(nèi)產(chǎn)生過多的藻膽蛋白，這些蛋白在體內(nèi)又可能形成包涵體，從而影響了脫輔基蛋白和色素的自催化重組結(jié)合，同時，培養(yǎng)基有效營養(yǎng)成分隨著細(xì)胞生長的消耗減少也會在一定程度上影響了細(xì)胞的增殖生長，因此在本實驗室條件的綜合考慮下，誘導(dǎo)表達(dá)的最適時間為14h.

2.2 最佳表達(dá)條件的確定 在單因素實驗的基礎(chǔ)上選取誘導(dǎo)表達(dá)溫度、誘導(dǎo)表達(dá)時間和誘導(dǎo)劑量進(jìn)

行正交實驗，考察這三個因素對藻膽蛋白提取率的影響。根據(jù)表1中三因素三水平的條件，設(shè)計L9(33)正交試驗表，采用極差分析與方差分析，以確定藻膽蛋白表達(dá)的最佳條件，試驗結(jié)果見表2、表3.

圖2 誘導(dǎo)時間對藻膽蛋白表達(dá)的影響

試管號因素A誘導(dǎo)溫度/℃B誘導(dǎo)時間/hC誘導(dǎo)劑量/mmol/LA560藻膽蛋白表達(dá)量/(mg/100mL)11(24)1(8)1(0.8)0.2896.021212(12)2(1.0)0.1984.125313(14)3(1.2)0.2465.12542(26)120.193.95852230.3026.29262310.3377.02173(28)130.4299.22783210.1944.04293320.54111.271K115.27119.20617.084K2 17.27114.45919.354K324.54023.41720.644k15.0906.4025.695k25.7574.8206.451k38.1807.8066.881R3.0902.9861.186

2.3 正交實驗結(jié)果分析

從表2中藻膽蛋白表達(dá)含量的極差分析(R)可以看出，在三個影響因素中，誘導(dǎo)表達(dá)溫度和誘導(dǎo)表達(dá)時間對其影響較大且兩者的影響程度相近，而誘導(dǎo)劑量的影響較小(即A>B>C).結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)溫度和誘導(dǎo)表達(dá)時間對藻膽蛋白表達(dá)影響較大，其主要原因有：溫度是重組細(xì)胞的生長、蛋白的表達(dá)以及脫輔基蛋白和色素有效結(jié)合的重要條件，它的主要作用體現(xiàn)于對重組細(xì)胞酶活的影響；誘導(dǎo)表達(dá)時間對蛋白的表達(dá)、細(xì)菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)、脫輔基蛋白和色素的有效的結(jié)合及培養(yǎng)基有效營養(yǎng)成分組成等有重要影響。從結(jié)果還可以看出，隨著誘導(dǎo)溫度的上升和誘導(dǎo)時間的延長，藻藍(lán)蛋白的表達(dá)含量不斷增加。因此，選擇誘導(dǎo)溫度為28℃，誘導(dǎo)時間為14h.本實驗所選擇的誘導(dǎo)劑量對于藻膽蛋白的表達(dá)含量影響最小，這一因素的三個水平中，隨著誘導(dǎo)劑量的增加，藻藍(lán)蛋白的表達(dá)含量也在不斷增加，綜合考慮可知，選擇第二個水平1mmol/L.綜上分析，在實驗設(shè)計的范圍內(nèi)，最好的實驗方案為A3B3C2，即誘導(dǎo)表達(dá)溫度為28℃，誘導(dǎo)表達(dá)時間為14h，誘導(dǎo)劑量為1.0mmol/L.方差分析表明，A、B、C三種因素對結(jié)果均無顯著性影響。

表3 因素方差分析

3 討論

本次實驗對含有三質(zhì)粒pACYCDuet-ho1-pcyA、pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA大腸桿菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。不可否認(rèn)的是，菌株的構(gòu)建是影響蛋白表達(dá)量的關(guān)鍵，好的菌種其自身質(zhì)粒拷貝數(shù)達(dá)到最優(yōu)配比，蛋白表達(dá)數(shù)量和質(zhì)量也最好。其次是外因條件對蛋白表達(dá)的影響。通過對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑量等主要因素研究，采用單因素實驗和正交試驗，優(yōu)化了藻膽蛋白表達(dá)的條件。結(jié)果表明，最優(yōu)條件為：誘導(dǎo)表達(dá)溫度為28℃、誘導(dǎo)表達(dá)時間為14h、誘導(dǎo)劑量為1.0mmol/L.經(jīng)分析，優(yōu)良的菌種在該工藝條件下，可高效表達(dá)藻膽蛋白。其中，誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間對表達(dá)量的影響最高。

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