華蟾素誘導(dǎo)L1210細胞凋亡及作用機制的研究

劉偉

華蟾素誘導(dǎo)L1210細胞凋亡及作用機制的研究

劉偉①

目的：探討華蟾素對離體小鼠急性淋巴細胞白血病L1210細胞的作用。方法：將L1210細胞分為對照組及藥物處理組。MTT實驗檢測細胞活性及增殖抑制情況；DNA 親和染料Hoechst 33258熒光染色觀察細胞核變化；Western Blot 檢測細胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平的改變。結(jié)果：華蟾素在0.25~1.0 μM濃度范圍內(nèi)即表現(xiàn)出顯著的細胞生長增殖抑制，而且有時間和濃度依賴性；Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)高濃度的華蟾素作用48 h，L1210細胞即表現(xiàn)出凋亡形態(tài)改變；Western Blot實驗表明，細胞凋亡通路相關(guān)蛋白Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9表達明顯高于對照組。結(jié)論：華蟾素有誘導(dǎo)L1210細胞凋亡的作用。

華蟾素； L1210細胞； 細胞凋亡； Caspase-3

白血病是危害兒童最嚴(yán)重、發(fā)病率最高的惡性腫瘤。隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染及工業(yè)材料的濫用，兒童白血病發(fā)病率逐年上升。目前，對兒童白血病的治療仍缺乏有效的藥物及治療方案。探討新型有效、低度誘導(dǎo)白血病細胞凋亡藥物是當(dāng)前白血病治療領(lǐng)域的重要任務(wù)。中藥素來以低毒優(yōu)越于西藥，所以，在眾多中藥品種中發(fā)現(xiàn)有潛在誘導(dǎo)白血病細胞凋亡、阻滯細胞增殖的藥物應(yīng)該是正確的方法。

華蟾素是中華大蟾蜍全皮的水溶性制劑，其化學(xué)成分復(fù)雜，具有低毒、抗癌譜廣的優(yōu)點。華蟾素制劑已經(jīng)用于臨床消化系統(tǒng)及婦科腫瘤的輔助治療，增強了化療藥物的藥理作用。華蟾素制劑用于血液系統(tǒng)腫瘤的研究較少，本文以L1210細胞為模型，研究華蟾素對L1210細胞的作用，并探討其分子機制，為臨床治療血液系統(tǒng)腫瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠急性淋巴白血病L1210細胞，購自中國科學(xué)院上海生化細胞研究所細胞庫。

1.2 試劑 華蟾素注射液購自深圳市三九醫(yī)藥貿(mào)易有限公司；MTT及Hoechst33258購自Sigma公司；DMSO購自Amresco；Anti-Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9， β-Actin antibody購 自 Santa Cruz；HRP-Goat anti-rabbit antibody 及ECL化學(xué)發(fā)光液購自普利萊基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞增殖實驗(MTT) 對數(shù)生長期細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，接種濃度1×104個/ml。邊緣孔不加，除去邊緣效應(yīng)。細胞接種24 h后，加入含不同濃度華蟾素的培養(yǎng)液，華蟾素初始濃度100 μmol/L， 依次倍比稀釋至終濃度 0.1 μmol/L，0.25 μmol/L，0.5 μmol/L，1.0 μmol/L，每個濃度無重復(fù)；對照組除不加華蟾素外其余均同加藥組；分別培養(yǎng) 12 h， 24 h， 36 h，48 h 后每孔加入 20 μl MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h，扣板法去除培養(yǎng)液，每孔加入200 μl DMSO，振蕩10 min直至藍色結(jié)晶物完全溶解，立即用全自動酶標(biāo)儀檢測OD570值。

1.3.2 Hoechst 33258染色觀察L1210細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化對數(shù)生長期細胞L1210按1×104個/ml濃度接種于提前用多聚賴氨酸處理的蓋片上。不同濃度的華蟾素處理48 h后，傾去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷PBS洗滌細胞2次；加入4%多聚甲醛4℃固定5 min；調(diào)整Hoechst 33258染液濃度至終濃度5 μg/ml，37 ℃避光染色15 min；棄去染液，在熒光顯微鏡下觀察拍攝。

1.3.3 Western Blot檢測細胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平的改變 對數(shù)生長期細胞接種至100 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜后加入不同濃度的華蟾素繼續(xù)培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)，加入冰預(yù)冷PBS洗兩次，細胞刮收集細胞。加入細胞裂解液50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.3 mol/L NaCl， 1% NP-40，0.1%去氧膽酸鈉，0.1% SDS， 1 mmol/L EDTA ， 50 mmol/L 氟化鈉，1 mmol/L 偏礬酸鈉；抑肽酶 20 μg/ml， 亮肽酶 10 μl/ml，(均購自 Amresco 公司 )，100 mmol/L PMSF( 購自 Sigma 公司 )。冰浴裂解30 min；16 000 g，4 ℃離心30 min，收集上清并加入loading buffer，震蕩混勻95℃水浴5 min。細胞總蛋白經(jīng)10 %SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜，PBST洗3次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；然后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，X光片暗室曝光、顯影及定影。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素對L1210細胞增殖的抑制作用 采用MTT法檢測不同濃度華蟾素對L1210細胞增殖抑制作用。從圖1可見，對數(shù)生長期L1210細胞加入華蟾素后均有不同程度的增殖抑制作用，隨著華蟾素濃度的增加，L1210細胞增殖抑制作用逐漸增加。而且，當(dāng)同一華蟾素濃度作用時間逐漸延長時，對L1210抑制作用逐漸增強。

圖1 不同濃度的華蟾素作用不同時間對L1210細胞活力的影響

2.2 華蟾素對L1210細胞誘導(dǎo)凋亡形態(tài)學(xué)變化 不同濃度華蟾素作用L1210細胞48 h后，細胞經(jīng)DNA親和染料Hoechst33258染色后發(fā)現(xiàn)，華蟾素作用細胞48 h，細胞發(fā)生了典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細胞皺縮、細胞核凝集、核碎片化(見圖2)。

圖2 華蟾素對L1210細胞形態(tài)戀化的影響

2.3 華蟾素誘導(dǎo)L1210細胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平的改變 不同濃度華蟾素作用L1210細胞48 h后，Western Blot檢測細胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平的改變。圖3所示，華蟾素能明顯誘導(dǎo)L1210細胞Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9表達增高，提示L1210細胞經(jīng)華蟾素作用后發(fā)生了凋亡。

圖3 華蟾素對細胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

華蟾素應(yīng)用于腫瘤治療已有多年的歷史。華蟾素抗腫瘤作用的機制主要有細胞毒性作用，直接作用于細胞DNA[1-2]；啟動細胞免疫機制增強宿主細胞免疫能力及特異性抗原殺傷能力[3-4]；誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用[5]；抑制腫瘤細胞血管生成作用[6-7]。華蟾素誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用在肝癌細胞及胃癌細胞中均見報道[8-9]，但具體凋亡發(fā)生機制還不清楚。

筆者首先使用不同濃度華蟾素作用L1210細胞不同時間，MTT實驗檢測細胞活性及增殖抑制情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞活性明顯低于對照組，說明華蟾素具有抑制L1210細胞增殖的作用。多種因素可以使細胞增殖發(fā)生抑制，比如細胞毒性、細胞自噬及壞死，細胞周期阻滯及細胞凋亡等。為進一步檢測L1210細胞增殖阻滯的分子機制，筆者首先觀察了細胞形態(tài)學(xué)改變。細胞形態(tài)學(xué)變化比較客觀地顯示了細胞經(jīng)華蟾素作用后發(fā)生了凋亡變化。即表現(xiàn)出細胞皺縮、細胞核凝聚、細胞核片段化改變等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。Western Blot進一步從蛋白分子水平上表明經(jīng)華蟾素作用，L1210細胞凋亡通路相關(guān)蛋白Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9表達水平增高，Caspase 是一個含有半胱氨酸活性的胞質(zhì)蛋白酶家族，迄今至少發(fā)現(xiàn)14 個成員。Caspase-3 是目前發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡過程中激活的關(guān)鍵酶，也是細胞凋亡的主要效應(yīng)分子[10]，Caspase-3激活后繼續(xù)激活一系列凋亡蛋白，使細胞發(fā)生不可逆性凋亡。所以這說明，華蟾素作用L1210細胞后細胞發(fā)生了凋亡。

發(fā)現(xiàn)新型抗癌活性高、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤治療領(lǐng)域的重要任務(wù)。本實驗充分證明，華蟾素在低濃度時及能誘導(dǎo)L1210細胞發(fā)生Caspase依賴性凋亡，為臨床應(yīng)用華蟾素治療兒童白血病提供了一定的理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1674-4985.2012.24.008

①河南省新蔡縣人民醫(yī)院 河南 新蔡 463500

劉偉

2012-04-05) (本文編輯：車艷)