白花蛇舌草懸浮細胞分批培養(yǎng)規(guī)律的研究

于瑞蓮，許金國，顧曉娟

(南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210029)

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Wild.)是一年生披散草本，屬茜草科(Rubiaceae)耳草植物的全草，廣泛分布于亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布于長江流域以南的廣東、廣西、福建等地。主要用于清熱解毒、利尿消腫、止痛抗菌、活血止痛。民間常用此藥內(nèi)服，治療小兒疳疾、毒蛇咬傷、癌腫及腸道疾病。外用治各種瘡瘍及跌打刀傷等癥;為治療腸癰、肝炎、泌尿系統(tǒng)感染等病的有效中藥。

白花蛇舌草化學成分研究發(fā)現(xiàn)了多糖［1］、黃酮甙車葉草甙和3個環(huán)烯萜類化合物、熊果酸、齊墩果酸等多種化合物［2］。藥理研究表明其具有增強動物免疫功能，保肝利膽，抗菌消炎等作用。近年來通過大量臨床實踐，發(fā)現(xiàn)本品有很好的抗腫瘤作用，臨床廣泛用于治療多種惡性腫瘤［3-4］。

本實驗利用從白花蛇舌草種子培育的試管苗的莖尖，建立了愈傷組織及懸浮細胞系，系統(tǒng)研究了其懸浮細胞系的建立與生長規(guī)律，從而為大規(guī)模培養(yǎng)提供了大量的理論與實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

白花蛇舌草種子由本校藥用植物教研室提供;白花蛇舌草愈傷組織由本實驗室誘導選育。

1.2 細胞懸浮系的建立

愈傷組織的誘導與繼代培養(yǎng)［5］:取白花蛇舌草試管苗的莖尖接種于MS+2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)4.0mg/L+Kt(激動素)0.5mg/L［5］+3% 蔗糖的培養(yǎng)基，將莖尖的愈傷組織轉(zhuǎn)接，進行繼代培養(yǎng)2～3次，每20 d繼代1次，采用100mL錐形瓶，裝液量50mL，0.8% 瓊脂粉固化，光照強度2 000 lx，光照時間12 h/d，溫度保持(26±1)℃。

懸浮細胞系的建立與培養(yǎng)［6］:將繼代培養(yǎng)15～20 d的生長均勻、質(zhì)地松散、淡黃色半透明狀愈傷組織2 g，置于含1mg/L NAA(α-萘乙酸)和3%蔗糖的液體培養(yǎng)基50mL中進行首次懸浮培養(yǎng)7～10 d后，以10%的接種量加入新鮮培養(yǎng)基進行第二代培養(yǎng)(以下各代均相同)，置旋轉(zhuǎn)搖床上，溫度(26±1)℃暗培養(yǎng)，120 r/min下進行懸浮培養(yǎng)。定期觀察培養(yǎng)液內(nèi)懸浮細胞或細胞團的生長變化，觀測數(shù)據(jù)均為3次重復，建立懸浮細胞生長曲線。

以上所有實驗如無特殊說明，均采用高壓蒸汽滅菌法，溫度控制在121～122℃，氣壓在103.421 kPa，滅菌30～40 min。

1.3 懸浮細胞生長的測定

采用500mL錐形瓶，裝液量250mL，培養(yǎng)基為MS+NAA 0.3mg/mL，且初始 pH 值為5.8～6.0，接入20%接種量的白花蛇舌草細胞種子液，置旋轉(zhuǎn)搖床上，培養(yǎng)溫度(26±1)℃，120 r/min振蕩暗培養(yǎng)20 d。培養(yǎng)結(jié)束后取細胞液40mL，4 000 r/min，離心20 min后倒盡上清液，稱重，將收集的培養(yǎng)物置于60℃ 烘箱中烘干至恒重，作為干重，換算成每1 L培養(yǎng)基的細胞干重克數(shù)，表示細胞生長量。所有數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值。

1.4 懸浮細胞培養(yǎng)液樣品的制備

白花蛇舌草懸浮細胞以15%的接種量，用旋轉(zhuǎn)式搖床以120 r/min、(26±1)℃進行懸浮培養(yǎng)，15 d后取培養(yǎng)液，10 000 r/min離心10 min后，取上清液備用。

1.5 接種量的測定

在添加了NAA 0.1mg/mL、蔗糖30 g/L且初始pH值為5.8～6.0的MS培養(yǎng)液中，分別接入10%，15%，20%，25%，30%接種量的白花蛇舌草細胞。在光照條件下培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)結(jié)束后，在孔徑0.4μm的濾網(wǎng)上減壓抽濾后稱其鮮重，然后將收集培養(yǎng)物置60℃ 烘箱中烘干至恒重，作為干重，換算成每天每升培養(yǎng)基增加的細胞干重克數(shù)，表示細胞生長速率。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值。

1.6 pH 測定

用精密pH計進行測定。

1.7 蔗糖含量測定

采用間苯二酚法，方法參見文獻［7］。

以蔗糖為對照品，制備的標準曲線方程為:A=2.058 3 C －0.026 5，r=0.995 1，其中A 為在480 nm波長的吸光度值，C為蔗糖濃度(mg/L)，線性范圍為0.024 4～0.544mg/L。

將細胞培養(yǎng)液樣品適當稀釋后，同法測定在480 nm波長的A值，依標準曲線算出各白花蛇舌草懸浮細胞培養(yǎng)液中蔗糖含量。

1.8 ［］含量的測定

方法見參考文獻［7-8］。以硫酸銨為對照品，制備的標準曲線方程為:A=0.030 7 C －0.012 3，r=0.995 9，其中A為480 nm波長處的吸光度值，C為硫酸銨濃度(mg/L)。

將細胞培養(yǎng)液樣品適當稀釋后，同法測定在480 nm波長處的A值，依標準曲線算出各白花蛇舌草懸浮細胞培養(yǎng)液中硫酸銨含量。

1.9 ［］含量測定

方法見參考文獻［7，9］。以硝酸鉀為對照品，制備的標準曲線方程為:A=0.260 8 C+0.011 5，r=0.991 9，其中A為360 nm波長處的吸光度值，C為硝酸鉀濃度(mg/L)。

將細胞培養(yǎng)液樣品適當稀釋后，同法測定在360 nm波長處的A值，依標準曲線算出各白花蛇舌草懸浮細胞培養(yǎng)液中［］含量。

1.10 多糖含量測定

采用苯酚硫酸法［10］。實際產(chǎn)生的多糖為總糖減去殘余蔗糖的量。以葡萄糖為對照品，制備的標準曲線方程為:A=9.168 8 C+0.002 3，r=0.998 8，其中A為490 nm波長處的吸光度值，C為葡萄糖濃度(mg/L)。

將細胞培養(yǎng)液樣品適當稀釋后，同法測定在490 nm波長處的A值，依標準曲線算出各白花蛇舌草懸浮細胞培養(yǎng)液中多糖含量。

2 結(jié)果

2.1 接種量測定

由圖1可以看出，當接種量達到15%時，細胞干重達到最大值，接種量繼續(xù)增大，細胞干重會大幅降低，在接種量到25%之后，細胞干重變化不大。

圖1 白花蛇舌草細胞懸浮培養(yǎng)液中不同接種量的細胞干重變化Fig.1 Effect of innocation amount in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

2.2 細胞生長的周期變化

由圖2可以看出，當培養(yǎng)時間達到9 d時，細胞干重達到最大值，以后的培養(yǎng)時間內(nèi)，細胞干重會略有減少。

圖2 白花蛇舌草細胞懸浮培養(yǎng)液中細胞干重周期變化Fig.2 Changes of CDW in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

2.3 細胞培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗變化

由圖4可以看出，隨培養(yǎng)時間的變化，pH很快減少，大約在9 d后就達到pH 3左右，說明在培養(yǎng)周期內(nèi)，細胞液中大量產(chǎn)生酸，或有生理酸性鹽被利用，但如果只是生理酸性鹽被利用而引起的pH降低，則pH不會降低這么多，說明還是有酸性物質(zhì)被生成。

培養(yǎng)液中的主要營養(yǎng)成分碳源——蔗糖，在培養(yǎng)開始時，有比較大的降低，在培養(yǎng)后期，細胞干重不再增加時，也不再有大的改變。

由圖4可以看出，隨培養(yǎng)時間的變化，多糖起先增加不是很多，隨培養(yǎng)的進行，在培養(yǎng)后期，逐漸大量生成，說明它和細胞的生長屬于非偶聯(lián)型。圖4中最終多糖的濃度為25 g/L，蔗糖的濃度18 g/L，兩者之和為43 g/L，高于蔗糖的初始濃度30 g/L，這可能是因為培養(yǎng)液中含有的其它含碳物質(zhì)也參與到了多糖的合成中。

圖3 白花蛇舌草細胞懸浮培養(yǎng)液中［］和［］周期變化Fig.3 Change of［］in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

圖4 白花蛇舌草細胞懸浮培養(yǎng)液中pH和多糖周期變化Fig.4 Change of pH and polysaccharide sustain cell suspension culture of Hedyotic diffusa

3 討論

在白花蛇舌草懸浮細胞培養(yǎng)時，最大的特點是，細胞大量繁殖，細胞濃度不斷增大，細胞干重達到最大值，當培養(yǎng)時間達到9 d時，pH很快減少，達到3左右，以后的培養(yǎng)時間內(nèi)，細胞生長減緩甚至停止，細胞出現(xiàn)衰老和凋亡，細胞干重會略有減少。說明在培養(yǎng)周期內(nèi)，細胞液中大量生成酸性物質(zhì)，致使細胞的生長受到抑制，這也被以后分離實驗所證實。

在白花蛇舌草懸浮細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中的主要營養(yǎng)成分氮源［］說明它被細胞生長優(yōu)先于［］利用，這和在一般的微生物培養(yǎng)中的規(guī)律不太一樣。但因生酸，生長受到抑制，細胞干重增加的不多，所以減少的量有限。

培養(yǎng)液中的主要營養(yǎng)成分碳源——蔗糖，在培養(yǎng)開始時，有比較大的降低，在培養(yǎng)后期，細胞干重不再增加時，也不再有大的改變。細胞液中多糖的量，隨培養(yǎng)時間的變化，多糖起先增加不是很多，隨培養(yǎng)的進行，在培養(yǎng)后期，逐漸大量生成，說明它和細胞的生長屬于非偶聯(lián)型。

因白花蛇舌草懸浮細胞系生長迅速，極具工業(yè)化潛力，本研究結(jié)果可為以后的大規(guī)模培養(yǎng)提供理論與實驗基礎(chǔ)，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

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