孫紅旭，戴恩來(lái)

(甘肅中醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，甘肅 蘭州730000)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征，近年來(lái)已成為嚴(yán)重危害老年人身心健康的常見病、多發(fā)病，是老年期癡呆中最常見的類型之一。因此深入探討VD 的病理生理機(jī)制以及尋求較為理想的防治藥物具有重要意義。通絡(luò)益智散是甘肅中醫(yī)學(xué)院戴恩來(lái)教授治療VD 的有效經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過長(zhǎng)期臨床應(yīng)用療效顯著。為進(jìn)一步探討該方對(duì)VD 的療效及作用機(jī)制，本研究以大鼠為研究對(duì)象，觀察該藥對(duì)大鼠行為學(xué)、海馬病理學(xué)的影響，以揭示其治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康Wistar 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量(250 ±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(甘)2011－0001。大鼠在自然光線、20～25 ℃環(huán)境溫度下，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥品、試劑與儀器

通絡(luò)益智散藥物組成:紅芪、當(dāng)歸、地龍、紅花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、遠(yuǎn)志，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。硝普納粉針劑，50 mg/支，北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)091011;尼莫地平，20 mg/片，山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)090811。跳臺(tái)儀，自制，為30 cm×30 cm×60 cm的被動(dòng)回避條件反射箱，用黑色塑料板分隔成3 間，底面鋪以銅柵，間距0.5 cm，可以通電，電壓強(qiáng)度由1 個(gè)變壓器控制;每間左后角置1 個(gè)高和直徑均為4.5 cm 的絕緣平臺(tái)(大鼠可停留在圓臺(tái)上回避電擊)。BCD－183 型可控低溫冰箱，青島澳柯瑪股份有限公司產(chǎn)品;AO 病理切片機(jī);H.H.S 21－4 型電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品;BX51/BX52型Olympus 系統(tǒng)顯微鏡，產(chǎn)地日本。

1.3 血管性癡呆模型的建立

參照藺心敬等［1］方法改進(jìn)方法。將大鼠用100 g/L水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后，頸正中部常規(guī)消毒后切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套“4”號(hào)絲線扣，拉緊絲扣，阻斷血流10 min 后松開絲扣使血液灌注10 min，共重復(fù)3 次;在距尾尖1 cm 處剪斷放血約1 mL;熱凝止血，第3 次再灌注后觀察30 min 后縫合皮膚，切口局部注射慶大霉素0.2 萬(wàn)U，術(shù)后肌注青霉素0.2 萬(wàn)U/d，連續(xù)3 d。假手術(shù)組大鼠只做麻醉，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不阻斷CCA 及腹腔注射硝普鈉。整個(gè)造模過程中，用肛表密切觀察大鼠肛溫，保持肛溫在37 ℃左右，以防止低溫對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

從60 只雄性Wistar 大鼠中隨機(jī)選出10 只作為假手術(shù)組，其余50 只采用上述方法制造VD 模型。手術(shù)過程由于喉返神經(jīng)受損、出血量過多、麻醉量太大而致6 只大鼠死亡，術(shù)后2 d 又相繼死亡4 只，后再無(wú)死亡，共剩余40 只大鼠。將此40 只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、通絡(luò)益智散大劑量組、通絡(luò)益智散小劑量組及尼莫地平組，每組各10 只。手術(shù)后第8 天通絡(luò)益智散大劑量組以通絡(luò)益智散3.14 g/mL 藥液灌胃，31.4 g/(kg·d);通絡(luò)益智散小劑量組以通絡(luò)益智散0.785 g/mL 藥液灌胃，7.85 g/(kg·d);尼莫地平組以尼莫地平1 g/L 混懸液灌胃，0.010 g/(kg·d);假手術(shù)組、模型對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥21 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 學(xué)習(xí)、記憶能力的檢測(cè)

造模后7 d 及術(shù)后4 周對(duì)大鼠進(jìn)行跳臺(tái)儀訓(xùn)練。訓(xùn)練前先將動(dòng)物放入箱中自由活動(dòng)3 min，熟悉環(huán)境，然后將動(dòng)物放置在圓臺(tái)上，接通銅柵電源(交流電，電壓36 V)，記錄動(dòng)物3 min 內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)(動(dòng)物跳下圓臺(tái)次數(shù))及受電擊總時(shí)間，作為學(xué)習(xí)訓(xùn)練成績(jī)記錄。24 h 后直接將動(dòng)物放置在圓臺(tái)上，記錄其從放入至第一次下臺(tái)受到電擊的時(shí)間(潛伏期)、5 min 后內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)及受到電擊總時(shí)間，作為記憶測(cè)試成績(jī)記錄。

1.5.2 海馬組織病理學(xué)觀察

術(shù)后第30 d 取材。用100 g/L 水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠;經(jīng)心灌注37 ℃生理鹽水50～100 mL，再先快后慢灌注含40 g/L 多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 值7.2)100～400 mL，30 min 灌注完畢。取出整腦，在冰盤上去除腦膜和血管，分離海馬稱質(zhì)量，在上述固定液內(nèi)浸泡12 h。40 g/L 甲醛溶液固定腦組織，石蠟包埋、冠狀切片厚度(4 μm)，HE 染色，光鏡下觀察。HE 染色程序如下:二甲苯I、II 中各浸泡脫蠟10 min→質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%、100%、95%、80%、70%乙醇各浸泡3 min→雙蒸水沖洗3 min→蘇木素染液中10 min→雙蒸水快速?zèng)_洗→質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分色數(shù)秒→雙蒸水沖洗1 min→質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%稀氨水返藍(lán)30 s→雙蒸水沖洗1 min→伊紅染液中1 min→雙蒸水沖洗30 s→質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、85%、95%、100%乙醇逐級(jí)脫水，各浸泡3 min→二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況對(duì)比

模型對(duì)照組大鼠大多表現(xiàn)為毛發(fā)零亂、精神萎靡、進(jìn)食減少、活動(dòng)減少、行動(dòng)遲緩;部分大鼠出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、自發(fā)運(yùn)動(dòng)增多或自我及互相嘶咬等癥狀。各治療組大鼠在術(shù)后1 周內(nèi)表現(xiàn)出與模型對(duì)照組類似的癥狀，但這些癥狀在1 個(gè)月內(nèi)逐漸減輕。假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)上述類似癥狀。

2.2 各組大鼠造模后跳臺(tái)測(cè)試結(jié)果對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)增多、受電擊時(shí)間延長(zhǎng)、觸電潛伏期縮短，差別有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明VD 模型成立。見表1。

表1 大鼠造模后跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)對(duì)比 ±s

表1 大鼠造模后跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)對(duì)比 ±s

注:與假手術(shù)組對(duì)比，＊＊ P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù)學(xué)習(xí)成績(jī)5 min 錯(cuò)誤次數(shù)/次 受電擊時(shí)間/s記憶成績(jī)5 min 錯(cuò)誤次數(shù)/次 受電擊時(shí)間/s 潛伏期/s假手術(shù)組 10 2.77±0.50 20.77±2.77 1.23±0.37 13.85±2.09 70.31±8.14對(duì)照組 40 5.31±0.67＊＊ 38.54±4.16＊＊ 4.77±0.67＊＊ 30.62±2.83＊＊ 15.25±11.82＊＊

2.3 通絡(luò)益智散對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的影響

治療后大、小劑量的通絡(luò)益智散及尼莫地平組大鼠的跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)和受電擊時(shí)間明顯少于模型對(duì)照組(P＜0.01 或P＜0.05)，同時(shí)大、小劑量的通絡(luò)益智散及尼莫地可使VD 大鼠潛伏期明顯增加(P＜0.01 或P＜0.05)。見表2。

表2 治療后各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)對(duì)比 ±s

表2 治療后各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)對(duì)比 ±s

注:與模型對(duì)照組對(duì)比，# P＜0.05，## P＜0.01;與通絡(luò)益智大劑量組對(duì)比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與尼莫地平組對(duì)比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù)學(xué)習(xí)成績(jī)5 min 錯(cuò)誤次數(shù)/次 受電擊時(shí)間/s記憶成績(jī)5 min 錯(cuò)誤次數(shù)/次 受電擊時(shí)間/s 潛伏期/s假手術(shù)組 10 0.88±0.84## 8.38±2.30## 0.68±0.52## 7.25±2.19## 133.38±5.17#模型對(duì)照組 10 4.38±1.30＊△△ 51.88±5.75＊＊△ 2.88±1.72＊△ 50.38±5.94＊＊△ 43.00±3.92＊＊△通絡(luò)益智大劑量組 10 2.13±0.99## 24.75±3.92# 1.25±0.71# 14.75±2.65# 122.25±3.05#通絡(luò)益智小劑量組 10 2.50±0.93#＊ 34.75±3.74##＊ 1.13±0.99#＊ 33.13±10.49##＊ 88.63±10.74##＊尼莫地平組 10 2.75±1.03# 16.38±2.70## 1.25±0.89# 21.38±3.74## 62.63±7.87##

2.4 通絡(luò)益智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組:海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核圓而大、核仁清晰，神經(jīng)纖維密集、排列整齊，膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)增生。模型對(duì)照組:海馬神經(jīng)細(xì)胞層次減少，排列稀疏，細(xì)胞核體積變小、核仁消失、深染，結(jié)構(gòu)不清，成核固縮表現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞增生形成多處結(jié)節(jié)。尼莫地平組:海馬CA1 區(qū)細(xì)胞排列較模型對(duì)照組整齊，形態(tài)較正常，水腫明顯減輕，海馬內(nèi)核固縮現(xiàn)象減輕，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生。通絡(luò)益智散大劑量組:與模型對(duì)照組相比改善明顯，與尼莫地平組比無(wú)明顯差異，海馬部位水腫明顯減輕，神經(jīng)元輕度變性，呈現(xiàn)可逆性改變，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生。通絡(luò)益智散小劑量組:與模型對(duì)照組相比改善明顯，與尼莫地平組略顯差異，海馬部位水腫減輕，神經(jīng)元輕度變性，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生。

3 討 論

3.1 通絡(luò)益智散對(duì)VD 大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的影響

動(dòng)物錯(cuò)誤次數(shù)、受電擊時(shí)間陽(yáng)性率越低，觸電潛伏期越長(zhǎng)，反映學(xué)習(xí)記憶力越強(qiáng)。跳臺(tái)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于正常對(duì)照組，表明該方法造成的動(dòng)物模型智力明顯下降，動(dòng)物有一定“癡”表現(xiàn)?；谀壳吧袩o(wú)與臨床十分吻合的血管性癡呆動(dòng)物模型，而該法造模與血管性癡呆的病因病機(jī)基本相似，因此，以此模型為基礎(chǔ)來(lái)觀察通絡(luò)益智散的作用及其機(jī)制是可行的。

經(jīng)用通絡(luò)益智散方藥治療后，動(dòng)物反應(yīng)能力明顯加強(qiáng)，即學(xué)習(xí)記憶能力明顯加強(qiáng)，揭示該方藥能明顯改善血管性癡呆動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，提高其智力，這與臨床應(yīng)用該方藥能改善智力的情況相吻合。

3.2 通絡(luò)益智散對(duì)VD 大鼠腦組織病理形態(tài)的影響

海馬是大腦一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，極易受損并極具可塑性。海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)亡［2］。目前認(rèn)為，其神經(jīng)元凋亡可能在VD 的發(fā)病過程中具有重要作用［3］?；诖耍x擇海馬CA1 區(qū)作為研究智能的主要部位，有著極其重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)VD 模型大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)受損，病理改變與行為學(xué)變化相一致，并伴有學(xué)習(xí)和記憶能力的下降，提示反復(fù)缺血再灌注所致海馬組織的神經(jīng)元損傷是學(xué)習(xí)、記憶功能受損的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過光鏡觀察大鼠腦組織海馬結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)通絡(luò)益智散能減輕海馬部位水腫、神經(jīng)元的變性，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增生從而防止VD 的發(fā)生。

［1］藺心敬，李呂力，王鐵建，等. 血管性癡呆大鼠模型的制備與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(12):733－735.

［2］Shaw CA，Petrik MS.Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration［J］. J Inorg Bio－chem，2009，103(11):1555－1562.

［3］Fang M，Li J，Tiu SC，et al .N－methyl－D－aspartate receptor and apoptosis in Alzheimer's disease and multiinfarct dementia［J］.J Neurosci Res，2005，81(2):269－274.