王 杰，韓曉彤，張 薇，李 霞

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，長沙410128)

連翹(Forsythia suspensa)是木犀科植物連翹屬落葉灌木，性寒、味苦，常以果實(shí)入藥，是中藥中最常見的藥材之一，具有清熱解毒、消結(jié)散腫、抗菌及抑制真菌等功能，常見的中成藥如雙黃連口服液、銀翹片等制劑均是以連翹果實(shí)作為主藥[1]。連翹苷和連翹酯苷是中藥連翹的主要生物活性組分，也是國家藥典所規(guī)定的連翹質(zhì)量控制指標(biāo)性成分[2](連翹苷含量不少于0.15%)。研究表明，連翹苷和連翹酯苷均具有較好的抗菌和抗病毒作用[3]。

研究顯示，連翹資源在我國非常豐富，且連翹屬植物葉子與果實(shí)的成分有較好的一致性，如:連翹葉中連翹苷含量遠(yuǎn)高于連翹果實(shí)，含量差別超過40倍[4]。對連翹葉及連翹果實(shí)的化學(xué)成分分析顯示:連翹苷、連翹脂素、齊墩果酸等生物活性成分在葉中含量均高于果實(shí)[4]，因此連翹葉具有十分廣泛的藥用價(jià)值。目前人們對于連翹的藥用價(jià)值主要集中在連翹果上，尚未見關(guān)于連翹葉的利用開發(fā)，因此對于其研究不僅有利于擴(kuò)大藥源，而且有利于連翹資源的綜合開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:連翹葉原料購于山西省運(yùn)城市百葉農(nóng)特產(chǎn)有限公司。

試劑:連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院);乙醇、甲醇均為分析純。

儀器:UV－2450型紫外分光光度計(jì)(日本島津)、DK－S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 連翹葉中連翹苷的提取方法

稱取2.0 g干燥的連翹葉粉于50 mL圓底燒瓶中，分別用濃度為 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液浸泡半小時(shí)后在溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下浸提 1、3、5、7、9、11 min，過濾收集濾液。

1.2.2 連翹苷的檢測方法

以連翹苷為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外分光光度法測定。測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=0.04754C+0.00386(R2=0.99705，n=5)。式中:A為波長223 nm處的吸光度;C為連翹苷的含量(mg/L)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取一定體積按1.2.1法提取的濾液，定容后紫外分光光度法檢測連翹苷含量。研究乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間及提取次數(shù)5個(gè)因素對連翹苷吸光度的影響，確定各因素的最佳范圍，每個(gè)因素重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以Design－Expert軟件(版本:8.0.5b，生產(chǎn)商:Stat－Ease，Inc.)采用四因素三水平的 Box－Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[5]，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)的值為自變量，以連翹苷的得率為因變量，研究響應(yīng)值以及最佳變量的組合[6]。試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。整個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)在中心點(diǎn)共有27次試驗(yàn)、3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)分兩天隨機(jī)完成。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對連翹苷得率的影響

在一定溫度、料液比下提取連翹葉一定時(shí)間，考察乙醇濃度對連翹苷得率的影響。由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)乙醇濃度到達(dá)70%以后，連翹苷得率隨著濃度增加變化不明顯，因此單次提取實(shí)驗(yàn)中乙醇濃度選擇為70%。

圖1 乙醇濃度對連翹苷得率的影響

2.1.2 料液比對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度下提取連翹葉一定時(shí)間，考察料液比對連翹苷得率的影響。由圖2可知，隨著料液比的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)乙醇濃度到達(dá)1∶12時(shí)，連翹苷得率上升趨勢逐漸變緩，結(jié)合考慮實(shí)際生產(chǎn)的綜合成本及生產(chǎn)效率，單次提取實(shí)驗(yàn)中料液比選1∶12。

圖2 料液比對連翹苷得率的影響

2.1.3 提取溫度對連翹苷得率的影響

在一定乙醇濃度、料液比下提取連翹葉一定時(shí)間，考察溫度對連翹苷得率的影響。由圖3可知，隨著溫度的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)溫度到達(dá)80℃后，隨著溫度的增加連翹苷得率變化不明顯，所以單次提取實(shí)驗(yàn)中溫度選80℃。

圖3 提取溫度對連翹苷得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度、料液比下提取連翹葉，考察浸提時(shí)間對連翹苷得率的影響。由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2 h后，隨著提取時(shí)間的增加連翹苷得率呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是由于時(shí)間過長導(dǎo)致連翹苷不穩(wěn)定，所以單次提取實(shí)驗(yàn)中時(shí)間選2 h。

圖4 提取時(shí)間對連翹苷得率的影響

2.1.5 提取次數(shù)對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度和一定料液比下提取連翹葉一定時(shí)間，考察提取次數(shù)對連翹苷得率的影響。由表2可知，連續(xù)提取4次以后，Abs的值接近于0，因此不再進(jìn)行第5次提取。用上述方式提取2次時(shí)，連翹苷的累積得率達(dá)到94.26%，此時(shí)隨著提取次數(shù)的增加，連翹苷得率受到的影響不大，綜合考慮得率及生產(chǎn)成本，提取次數(shù)為2次。

表2 不同提取次數(shù)的連翹葉中連翹苷得率

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Design－Expert軟件，依據(jù)BBD的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定了四因素三水平的響應(yīng)面分析法，提取次數(shù)均為兩次。連翹苷的提取結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)和連翹苷得率

2.2.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，回歸模型的失擬項(xiàng)為0.8347，沒有顯著性差異;p值小于0.0001，表明模型處理間差異極顯著。其R2值為0.9635，表明此模型能解釋96.35%響應(yīng)值變化，這表明該模型具有良好的相關(guān)性?；貧w模型各項(xiàng)的方差分析還表明，各因素料液比的一次項(xiàng)是顯著的，交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD，二次項(xiàng) C2、D2都表現(xiàn)為極高的顯著性，說明該模型的擬合度好。

利用Design Expert軟件，對試驗(yàn)設(shè)計(jì)各組合處理得到的連翹苷得率進(jìn)行二次回歸分析，建立多元響應(yīng)面回歸模型 y=－0.701－2.400E－003A－0.0406B+0.0339C+0.0240D+1.300E－004AB+7.100E－005AC+6.050E－004AD+3.650E－004BC+3.525E－003BD+1.300E－004CD－4.189E－005A2－5.033E－005B2－2.713E－004C2－0.0294D2。

由回歸方程經(jīng)處理得到的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間之間的交互作用對連翹苷得率影響的響應(yīng)面及其等高線如圖6所示。其中料液比和提取溫度的交互作用對連翹苷得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面落差較大，乙醇濃度和提取溫度的交互作用次之。其余因素之間的交互作用也表現(xiàn)出較顯著的效果。通過對圖5的分析可以看出，在此4個(gè)因素中，料液比對連翹苷得率的影響最為顯著，其余依次為乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度。此外，各交互因素的最佳作用點(diǎn)基本都落在了試驗(yàn)范圍之內(nèi)，證明此響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)較為合理。

圖5 乙醇濃度、料液比、溫度、時(shí)間交互作用對連翹苷得率影響響應(yīng)面

2.2.3 模型的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過連翹苷得率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得出從連翹葉中提取連翹苷的最佳工藝條件參數(shù)為:乙醇濃度80%，料液比1∶14，提取溫度83℃，提取時(shí)間2 h，在此條件下，連翹苷最高得率預(yù)測值0.3960%。為驗(yàn)證RSA法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行連翹苷提取試驗(yàn)，重復(fù)3次得到連翹苷得率的平均值為0.3895%，與理論預(yù)測值相差不大，因此，采用RSA法優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化出連翹葉中連翹苷最佳提取條件為:乙醇濃度為80%，料液比為1∶14，提取溫度為83℃，提取時(shí)間為2 h，在此條件下的連翹苷得率預(yù)測為0.3895%。

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