李國輝，鐘其頂，高紅波，熊正河，肖冬光

1(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

黃酒營養(yǎng)最豐富，富含各類氨基酸，其氨基酸主要來自原料及微生物的代謝作用，氨基酸種類及含量高低是評價黃酒風(fēng)味和營養(yǎng)質(zhì)量的一項重要指標(biāo)［1］。

氨基酸的檢測方法有顯色法［2］、氨基酸自動分析儀法［3］、高效液相色譜法［4］和毛細(xì)管電泳法［5］。目前，采用氣相色譜分離檢測氨基酸的方法在國際上已有報道［6－8，10－12］，在穩(wěn)定同位素標(biāo)記的黃酒氨基酸代謝流分析中，由于同位素質(zhì)譜儀與液相色譜聯(lián)機(jī)局限性，基于液相分離的黃酒氨基酸無法注入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀測定。因此，開發(fā)一種基于氣相色譜分離檢測氨基酸的方法具有重要現(xiàn)實意義。

采用氣相色譜分離的氨基酸檢測方法需將氨基酸轉(zhuǎn)化為非極性易揮發(fā)的衍生物，衍生方法主要包括:硅烷化、酯化和?；?。其中硅烷化反應(yīng)具有一步加熱反應(yīng)完成，反應(yīng)條件相對溫和、快速，操作簡便，衍生樣品可直接進(jìn)行儀器分析等優(yōu)點(diǎn)。目前用于甲基硅烷化反應(yīng)的衍生試劑主要有N，O-雙三甲硅烷基乙酰胺(BSA)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)、N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)及N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氯乙酰胺(MTBSTFA)反應(yīng)形成叔丁基二甲基氯硅烷(TBS)衍生物［13］。而MTBSTFA在分析化合物特征離子及穩(wěn)定性方面更優(yōu)于BSTFA［14］。衍生原理如下:在氨基酸的氨基和羧基端分別連接-TBDMS基團(tuán)，經(jīng)高溫裂解之后，部分化學(xué)鍵將沿圖1所示的虛線處斷裂，測定氨基酸特定基團(tuán)R［15］。

圖1 MTBSTFA衍生氨基酸產(chǎn)物及其斷裂位點(diǎn)

本研究建立了一種以MTBSTFA為衍生試劑檢測黃酒中主要游離氨基酸的GC-FID方法，為建立氣相-燃燒-同位素比率質(zhì)譜(GC-C-IRMS)測定黃酒中氨基酸13C穩(wěn)定同位素豐度檢測方法和黃酒氨基酸穩(wěn)定同位素代謝流分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 儀器

氣相色譜儀(Agilent 6890，Agilent Technologies公司)，氫離子火焰檢測器，高效液相色譜儀(waters 2695，Waters公司)，恒溫水浴鍋(Thermo star-95)，氮吹儀(MTN-2800D)，分析天平(Mettler Toledo AB204-N)等。

1.2 試劑

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(Waters公司)，衍生試劑N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(≥95%，購自Sigma–Aldrich公司)，輔助衍生試劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈(ACN)為國產(chǎn)色譜純。

1.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別準(zhǔn)確稱取各氨基酸標(biāo)樣0.100 0 g，用0.1 mol/L HCl定容至100 mL，4℃保存，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用時稀釋，分別設(shè)置50～500mg/L不同的濃度梯度。

1.4 衍生條件

取一定濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液50 μL置于2 mL進(jìn)樣瓶中，氮吹儀下40℃吹干。加入100 μL輔助衍生試劑DMF和100 μL衍生試劑 MTBSTFA，80℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，待測。

1.5 色譜條件

DB-5毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm，Agilent Technologies);載氣為氮?dú)?柱流速1 mL/min;進(jìn)樣口溫度250℃;升溫程序為:起始溫度120℃，保持2 min，，保持10 min;進(jìn)樣體積1 μL;分流比 20∶1。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取50～500 mg/L的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，氮吹儀下40℃吹干，加入衍生試劑和輔助衍生試劑，80℃衍生，60 min。冷卻至室溫后進(jìn)行GC-FID檢測。

1.7 樣品測定

取4℃下10 000 r/min離心10 min后的黃酒上清液50 μL，氮吹儀下40℃吹干。按上述1.4條件衍生，衍生后0.22 μm微孔濾膜過濾，冷卻至室溫待測。

1.8 回收率及精密度

取4℃下10 000 r/min離心10 min后的黃酒上清液50 μL，加入不同濃度的各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，按1.7方法處理。分別衍生處理5次，計算RSD值。

1.9 HPLC法測定黃酒中氨基酸含量

方法見文獻(xiàn)［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸衍生條件優(yōu)化

衍生反應(yīng)的效率與反應(yīng)條件密切相關(guān)，部分文獻(xiàn)報道氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液使用純水配制較使用0.1 mol/L HCl配制時谷氨酸和絲氨酸的衍生效果會稍有提高［17］。但是由于黃酒自身的微酸性性質(zhì)，本實驗不討論純水與0.1 mol/L HCl對衍生效率的影響。主要從反應(yīng)溫度、時間和試劑對衍生效果進(jìn)行比較優(yōu)化。

分別選取谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)和賴氨酸(Lys)作為參考氨基酸。其中各氨基酸的峰面積加和表示衍生效率。分析結(jié)果顯示在不同衍生條件下DMF的輔助衍生效果均優(yōu)于ACN(圖2)。

圖2 不同時間和溫度下ACN和DMF輔助衍生效率比較

由圖3可知，使用DMF輔助衍生試劑在80℃反應(yīng)60min時，衍生效果最好。綜合各項條件，選用DMF為輔助衍生試劑，在80℃、60 min條件下進(jìn)行衍生，且各氨基酸衍生峰分離度良好(圖4)。

圖3 不同衍生條件下DMF輔助衍生效率比較

圖4 氨基酸經(jīng)MTBSTFA衍生GC-FID分析圖譜

2.2 準(zhǔn)確性和回收率

采用上述衍生條件，分別以各種氨基酸峰面積y對各氨基酸含量x(mg/L)作線性回歸。各回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2除脯氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸為0.98外，其余氨基酸均大于0.99，相關(guān)性良好;LOD(3S/N)為0.61～7.13 mg/L(見表1)。

取同一黃酒樣品衍生后，連續(xù)測定5次，RSD在0.4% ～2.9%之間，方法重復(fù)性良好。

樣品加標(biāo)回收實驗結(jié)果表明，除精氨酸外，黃酒中氨基酸加標(biāo)回收率在87.11%～119.47%之間;RSD為0.5% ～4.6%(n=5)，滿足黃酒中微量氨基酸含量準(zhǔn)確測定要求。由圖4A和4B可見，在一定濃度下精氨酸與衍生試劑結(jié)合后所獲得FID信號較弱。分析其原因，精氨酸與主鏈最接近的旁鏈部分較長、而另一端的旁鏈則是一個胍基。胍基的酸度系數(shù)(PKa值)為12.48，在中性、酸性或堿性的環(huán)境下都帶正電荷。在其雙鍵及氮孤立電子對之間的共軛體系，使得胍基能形成多重的氫鍵。進(jìn)而在與衍生試劑結(jié)合之后R基團(tuán)不易斷裂。

表1 17種氨基酸的線性方程及相關(guān)系數(shù)

表2 樣品加標(biāo)回收率

同一黃酒樣品分別通過GC-FID和HPLC-UV檢測分析，測定結(jié)果基本一致(見表3)。經(jīng)SPSS雙變量相關(guān)分析，皮爾遜相關(guān)系數(shù)R為0.998(見表4)，表明本方法與成熟的HPLC方法具有可比性，且準(zhǔn)確性較高。

表3 不同方法對黃酒中氨基酸檢測結(jié)果比較

表4 GC-FID與HPLC測定結(jié)果相關(guān)性分析

2.3 GC-C-IRMS初步測定

利用GC-FID的衍生和測定條件，使用 GC-CIRMS對氨基酸衍生樣品進(jìn)行初步測定，如圖5所示。17種氨基酸均出峰，且分離度良好，可有效測定各氨基酸穩(wěn)定碳同位素比值(δ13C)。

圖5 氨基酸衍生物中δ13C經(jīng)GC-C-IRMS分析譜圖

3 結(jié)論

本研究建立以MTBSTFA為衍生試劑，測定黃酒中17種游離氨基酸的GC-FID方法。該方法操作簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適合黃酒中游離氨基酸的定量分析;基于氣相分離原理，為今后開發(fā)GC-C-IRMS測定黃酒中氨基酸同位素方法奠定了良好基礎(chǔ)。

［1］顧國賢.釀酒工藝學(xué)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1996.

［2］Yemm E W，Cocking E C，Ricketts R E.The determination of amino-acids with ninhydrin ［J］.Analyst，1955，80(948):209－214.

［3］Alonzo N，Hirs C.Automation of sample application in amino acid analyzers［J］.Analytical Biochemistry，1968，23(2):272－288.

［4］Einarsson S，Josefsson B，Lagerkvist S.Determination of amino acids with 9-fluorenylmethyl chloroformate and reversed-phase high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1983，282:609－618.

［5］Wan H，Blomberg L G.Chiral separation of amino acids and peptides by capillary electrophoresis ［J］.Journal of Chromatography A，2000，875(12):43－88.

［6］Evershed R P.Advances in silylation［J］.Handbook of Derivatives For Chromatography，1993:51－108.

［7］Peace R W，Gilani G S.Chromatographic determination of amino acids in foods［J］.Journal of AOAC International，2005，88(3):877－887.

［8］Husêk P.Rapid derivatization and gas chromatographic determination of amino acids［J］.Journal of Chromatography A，1991，552(1):289－299.

［9］Erbe T，Bruckner H.Chromatographic determination of amino acid enantiomers in beers and raw materials used for their manufacture［J］.Journal of Chromatography A，2000，881(1):81－91.

［10］Kim K R，Kim J H，Cheong E，et al.Gas chromatographic amino acid profiling of wine samples for pattern recognition［J］.Journal of Chromatography A，1996，722(2):303－309.

［11］Silva B M，Casal S，Rade P B，et al.Development and evaluation of a GC/FID method for the analysis of free amino acids in quince fruit and jam ［J］.Analytical Sciences，2003，19(9):1285－1290.

［12］Nozal M.Rapid and sensitive method for determining free amino acids in honey by gas chromatography with flame i-onization or mass spectrometric detection［J］.Journal of Chromatography A，2004，1047(1):137－146.

［13］Shareef A，Angove M J，Wells J D.Optimization of silylation using N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide，N，O-bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide and N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide for the determination of the estrogens estrone and 17［alpha］-ethinylestradiol by gas chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2006，1108(1):121－128.

［14］Schummer C，Delhomme O，Appenzeller B M R，et al.Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reactions of polar compounds prior to GC/MS analysis［J］.Talanta，2009，77(4):1473－1482.

［15］Tang Y J，Martin H G，Myers S，et al.Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via13C isotopic labeling［J］.Mass Spectrometry Reviews，2009，28(2):362－375.

［16］鐘其頂，高紅波，熊正河，等.PITC柱前衍生高效液相色譜法測定黃酒中17種氨基酸方法研究［J］.釀酒，2010(005):74－76.

［17］張佳，王川丕，阮建云.GC-MS及GC測定茶葉中主要游離氨基酸的方法研究［J］.茶葉科學(xué)，2010，30(6):445－452.