張西云，范玉霞，胡國(guó)元，李生慶，李秀萍

（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧810016）

青海省海北州祁連縣默勒鎮(zhèn)2006～2008年綿羊發(fā)生持續(xù)死亡，死亡數(shù)達(dá)6 554只，發(fā)病前，該地區(qū)每年3～4月用羊三聯(lián)苗免疫羊群，但仍然有大量羊只發(fā)生死亡，經(jīng)我室確診為腸毒血癥后，采用產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C60－2（D型），采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方使該菌的產(chǎn)毒能力提高到3萬(wàn)MLD／mL，制成羊腸毒血癥菌苗后2009年、2010年在青海祁連默勒地區(qū)免疫綿羊105 000只，結(jié)果免疫羊群均未發(fā)生本病。為該地區(qū)羊腸毒血癥的發(fā)生和流行提供了有效的菌苗，很大程度上減少了牧民的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料

標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌C60－2菌株（來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所）；VF培養(yǎng)基（本室自制）；健康家兔1.5～2kg購(gòu)自樂(lè)都種兔場(chǎng)；16～20g小鼠購(gòu)自地方病研究所；甲醛；氫氧化鋁膠（本室自制）。

2 方法

2.1 基礎(chǔ)液制備 將產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C60－2（D型）接種到加生肝的V.F培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，用16～20g小鼠測(cè)定毒力。

將培養(yǎng)24h的種子培養(yǎng)物接種至1萬(wàn)mL的大瓶中，37℃培養(yǎng)24h。

2.2 最小致死量測(cè)定 吸取大瓶24h培養(yǎng)物1mL，加含2.5g／L胰酶的1%碳酸鈉溶液1mL，37℃活化45min，5 000r／min離心15min，上清用生理鹽水10倍遞減稀釋?zhuān)恳幌♂尪褥o脈注射小鼠2只（0.2mL／只）。觀(guān)察記錄結(jié)果。

2.3 脫毒 按菌液量的1%加入甲醛后密封，37℃～38℃殺菌脫毒14d，每d充分振蕩2次。將脫毒后的樣品接種至加生肝的厭氣肝湯、普通肉湯、普通斜面上［1］，37℃培養(yǎng)7d觀(guān)察記錄。

2.4 安全檢驗(yàn) 將脫毒后的樣品經(jīng)胰酶活化離心，上清靜脈注射體重16～20g小鼠2只，每只0.4 mL，觀(guān)察記錄結(jié)果。結(jié)果：基礎(chǔ)液最小致死量為3萬(wàn)MLD／mL；無(wú)菌檢驗(yàn)，加生肝的厭氣肝湯、普通肉湯及普通斜面培養(yǎng)基上均無(wú)菌生長(zhǎng)；脫毒的樣品經(jīng)胰酶活化離心，上清注射的小鼠健活，脫毒完全。

2.5 制苗 經(jīng)滅活、脫毒檢驗(yàn)合格的基礎(chǔ)液，用銅紗濾過(guò)，用于配苗。先將檢驗(yàn)合格的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的脫毒基礎(chǔ)液按基礎(chǔ)液4份加鋁膠1份的比例，加入滅菌的氫氧化鋁膠，再按全部容量的0.01%加入硫柳汞充分混合。

制苗完成后，取樣做無(wú)菌檢查，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，充分混合，定量分裝。

2.6 菌苗檢驗(yàn) 本品靜置后，上層為黃褐色澄明液體，下層為灰白色的沉淀，振搖后呈均勻混懸液。

無(wú)菌檢驗(yàn)：將菌苗接種至生肝的厭氣肝湯、普通肉湯、普通斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7d均無(wú)菌生長(zhǎng)。

安全檢驗(yàn)：用體重1.5～2kg家兔4只，各肌肉注射菌苗5mL，觀(guān)察14d。未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)，注射部位有蠶豆大硬結(jié)。

效力檢驗(yàn)：取1.5～2kg家兔20只，隨機(jī)分成4組，免疫組15只，均為皮下注射；對(duì)照組5只。飼養(yǎng)至18d，靜脈攻毒，觀(guān)察菌苗保護(hù)情況。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌苗保護(hù)情況

2.7 苗的現(xiàn)地使用 2009年6月初在祁連默勒地區(qū)用該苗進(jìn)行小群免疫試驗(yàn)，免疫羊只20只，觀(guān)察21d，未見(jiàn)不良反應(yīng)，2009年7月初及2010年7月初在該地區(qū)分別免疫羊只6.5萬(wàn)只和4萬(wàn)只，疫苗用時(shí)搖勻，不論羊只年齡大小，肌肉或皮下注射2mL。2009年及2010年免疫羊只均未發(fā)生羊腸毒血癥病。

3 結(jié)果與討論

通過(guò)菌苗的安檢、效檢及現(xiàn)地使用，證明該苗安全有效，是預(yù)防綿羊腸毒血癥的可靠菌苗。為解決祁連默勒地區(qū)使用羊三聯(lián)苗后仍發(fā)生羊腸毒血癥的現(xiàn)狀提供了保障。