蒲忠慧，杜永華，魏 琴，尹禮國(guó)，張 萍，張 龍，羅明華

（1.綿陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 綿陽(yáng)621000；

2.宜賓學(xué)院 發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓644007；3.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓644007）

仙茅為石蒜科植物（Curculigoorchioides Gaertn）的干燥根莖，味辛，性熱，有毒；具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、保肝、抗高血糖、補(bǔ)腎壯陽(yáng)及抗骨質(zhì)疏松、抗炎和適應(yīng)原樣等功效［1］，可用于陽(yáng)痿精冷，筋骨萎軟，腰膝冷痹，陽(yáng)痿冷泄等。研究表明，仙茅含有仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷等化學(xué)成分［2］；仙茅苷對(duì)自由基具有明顯的清除作用［3］，還具有免疫調(diào)節(jié)［4］和抗骨質(zhì)疏松［1］等作用。目前，對(duì)仙茅的研究主要集中在化學(xué)成分及藥理活性方面，而對(duì)仙茅提取工藝的研究較少，聶詩(shī)明等［5］研究過(guò)仙茅水提液的提取工藝，對(duì)仙茅醇提物的工藝研究，罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法，以仙茅醇提物中的仙茅苷提取率為指標(biāo)，選取粒度、乙醇濃度、固液比、浸泡時(shí)間及回流時(shí)間5個(gè)因素，優(yōu)選出仙茅最佳提取工藝，并對(duì)其結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證，為生產(chǎn)工藝的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 仙茅根，產(chǎn)地為四川，購(gòu)自四川宜賓正源藥業(yè)有限公司，由其鑒定為石蒜科植物仙茅（CurculigoorchioidesGaertn）的干燥根莖；仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)：110771－200904，含量≥98%。

1.2 儀器與試劑 中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R502B（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；SW－CJ－IB型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；恒溫水浴鍋（鞏義市英峪高科儀器廠(chǎng)）；所有試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 仙茅苷含量的測(cè)定

2.1.1 供試液的制備 精密稱(chēng)取仙茅浸膏0.2g，加60mL蒸餾水，超聲處理20min，冷至室溫，過(guò)濾。濾液用乙酸乙酯萃取4次（30、20、15、15mL），合并4次萃取液，水浴蒸干，殘?jiān)?0mL甲醇超聲溶解，冷至室溫，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱(chēng)取仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，加甲醇溶解后定容至100mL容量瓶中，搖勻即得50μg／mL的仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密吸取仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL分別置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，于282nm處測(cè)定吸收度［6］，得吸光度和質(zhì)量濃度回歸方程為y＝0.0105x－0.0045，R2＝0.9996，結(jié)果表明，仙茅苷在10～50 μg／mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，RSD為0.41%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試液5.0mL，分別在不同時(shí)間測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，取平均值，RSD為4.41%，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性較好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批仙茅浸膏5份，各取0.2g，按上述供試液制備方法處理，測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，RSD為2.44%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.7 回收率試驗(yàn) 取已測(cè)得仙茅苷含量的仙茅浸膏5份，各0.2g，分別精密加入仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)液10.0mL（500μg），按供試液制備方法處理，計(jì)算回收率，平均回收率為92.76，RSD為1.0%，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 均勻試驗(yàn)安排 參考 Fudx［7］等的提取方法，對(duì)粉碎粒度、乙醇濃度、固液比、浸泡時(shí)間及回流時(shí)間5個(gè)影響仙茅苷提取率的因素進(jìn)行考察，選取5因素10水平表（見(jiàn)表1）進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，將仙茅根粉碎過(guò)篩，取100g，按以下條件（見(jiàn)表2），安排試驗(yàn)。

水平 因素粒度（目）乙醇濃度（%）液固比（倍）浸泡時(shí)間（h） 回流時(shí)間（h）1 10～20 10 5 0.0 1.0 2 10～20 20 6 0.5 1.5 3 20～40 30 7 1.0 2.0 4 20～40 40 8 1.5 2.5 5 40～60 50 9 2.0 3.5 6 40～60 60 10 2.5 4.0 7 60～80 70 11 3.5 4.5 8 60～80 80 12 4.0 5.0 9 80～100 90 13 4.5 5.5 10 80～100 100 14 5.0 6.0

試驗(yàn)號(hào) 因素χ1 χ2 χ3 χ4 χ5 1 1 3 4 5 9 2 2 6 8 10 7 3 3 9 1 4 5 4 4 1 5 9 3 5 5 4 9 3 1 6 6 7 2 8 10 7 7 10 6 2 8 8 8 2 10 7 6 9 9 5 3 1 4 10 10 8 7 6 2

2.2.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 樣品含量測(cè)定結(jié)果 采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排的仙茅浸膏的提取結(jié)果及仙茅苷提取率結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知，試驗(yàn)條件5仙茅浸膏得率和仙茅苷提取率最高，其提取工藝為：粒度40～60目，乙醇濃度40%，液固比13倍，浸泡時(shí)間1h，回流時(shí)間1h。

2.2.2.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 采用 Uniform Design Version 3.00對(duì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行后退回歸分析，在顯著水平α＝0.10時(shí)，第一次回歸方程為y＝0.830 1－0.005 1x1＋0.000 7x2＋0.030 9x3－0.067 0 x4－0.071 8x5，復(fù)相關(guān)系數(shù)：R＝0.931 7；決定系數(shù)：R2＝0.868 1；F檢驗(yàn)值（5.267）＞F臨界值（4.051）回歸方程顯著，剩余標(biāo)準(zhǔn)差s＝0.106 62，顯著性檢驗(yàn)變量分析見(jiàn)表4。各自變量對(duì)仙茅苷的貢獻(xiàn)（偏回歸平方和）順序?yàn)榱６龋?.119 7）＞回流時(shí)間（0.100 9）＞浸泡時(shí)間（0.078 1）＞液固比（0.058 2）＞乙醇濃度（0.003 3）。其中，藥材粒度、液固比、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)仙茅苷提取率有顯著影響，而乙醇濃度對(duì)仙茅苷提取影響不明顯。這是因?yàn)橄擅┸帐撬苄晕镔|(zhì)，在乙醇中溶解度不高，在用乙醇對(duì)仙茅根粉進(jìn)行提取時(shí)，水溶性雜質(zhì)相對(duì)增高且不便于與待測(cè)試成分分離，對(duì)仙茅苷提取影響不明顯。

表3 仙茅含量測(cè)定結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照仙茅苷提取的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)回歸方程進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測(cè)：粒度10～20目，液固比13倍，浸泡時(shí)間0h，回流時(shí)間1h。按上述條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，煎煮液的仙茅苷含量為0.98%，在預(yù)測(cè)范圍內(nèi)（1.14%±0.199），表明該優(yōu)化條件是可行的。

表4 變量分析

3 分析與討論

3.1 本試驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定仙茅中仙茅苷含量結(jié)果顯示，仙茅苷含量（0.94%）與黃燦華等［6］用紫外分光光度法測(cè)得的仙茅苷含量（1.03%）相近，而比聶詩(shī)明等［5］采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選仙茅煎煮工藝得到的最高仙茅苷含量（50.78mg／100g）高。究其原因，一方面可能是醇提法比水煎煮法更易提取出仙茅中仙茅苷，另一方面也可能是由于提取過(guò)程中樣品處理方式以及含量測(cè)定方法的不同而引起的差異。聶詩(shī)明等仙茅將提取液經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后再采用高效液相色譜法測(cè)定仙茅苷的含量，而本試驗(yàn)所得樣品只經(jīng)過(guò)乙酸乙酯萃取純化處理，可能在處理過(guò)程中仙茅苷的損失較少。文獻(xiàn)報(bào)道［8－9］，高效液相色譜法測(cè)定仙茅中仙茅苷的含量均在0.1%～0.5%左右，均低于本試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果，其原因可能是含量測(cè)定方法的差異對(duì)仙茅苷含量測(cè)定結(jié)果影響較大?？梢?jiàn)仙茅苷含量測(cè)定方法的選擇是很重要的。

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品溶液在9h以?xún)?nèi)測(cè)定的吸光度值無(wú)明顯變化，放置22.5h后測(cè)得的吸光度有所減少，RSD值偏大（4.41）。這可能是因?yàn)橄擅┸帐艿酵饨绛h(huán)境中的氧、水分等因素的影響，發(fā)生了化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，而引起吸光度的變化。因此，供試液應(yīng)及時(shí)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，對(duì)提取出來(lái)的仙茅浸膏、仙茅苷標(biāo)準(zhǔn)品也應(yīng)及時(shí)保存在4℃的冰箱內(nèi)，這樣可保證樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中仙茅苷的穩(wěn)定性。

3.3 本試驗(yàn)通過(guò)均勻設(shè)計(jì)法考察仙茅的最佳提取工藝，結(jié)果表明，試驗(yàn)條件5仙茅浸膏得率和仙茅苷提取率最高，其提取工藝為：粒度：40～60目，乙醇濃度40%，液固比13倍，浸泡時(shí)間1h，回流時(shí)間1h。經(jīng)過(guò)后退回歸處理結(jié)果表明，對(duì)仙茅提取結(jié)果影響大小依次液固比、粒度、回流時(shí)間、浸泡時(shí)間，而乙醇濃度對(duì)其無(wú)影響。對(duì)剔除不顯著因素乙醇濃度后采用網(wǎng)格嘗試優(yōu)化法［10］對(duì)重要的四個(gè)因素（粒度、液固比、浸泡時(shí)間、回流時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝為：粒度10～20目，液固比13倍，浸泡時(shí)間0h，回流時(shí)間1h，仙茅苷提取率的實(shí)測(cè)值（0.98%）在預(yù)測(cè)范圍內(nèi)（1.14%±0.199），表明該工藝條件可行，比較經(jīng)濟(jì)，且對(duì)提取設(shè)備條件要求低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，通過(guò)回歸方程找到最優(yōu)化條件，預(yù)測(cè)性強(qiáng)，是優(yōu)化中草藥提取工藝的有效方法。

［1］曹大鵬.仙茅抗骨質(zhì)疏松化學(xué)成分及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究［D］.長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［2］徐俊平，董親頤.仙茅化學(xué)成分的研究及仙茅甙、苔黑酚葡萄糖甙的分離鑒定［J］.中草藥.1986，17（16）：8.

［3］吳瓊，程小衛(wèi)，雷光青，等.仙茅苷對(duì)自由基的清除作用［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24（1）：6－9.

［4］Kubo M，Namba K，Nagatnoto N，etal.A new phenolic glucoside，Curculigoside from rhizomes of Curculigo orchioides［J］.Planta Medica，1983，47：52－55.

［5］聶詩(shī)明，張麗萍，盧水珍，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選仙茅提取工藝的研究［J］.中成藥，2002，24（9）：665－667.

［6］黃燦華，吳美香，曾衛(wèi)陽(yáng)，等.紫外分光光度法測(cè)定仙茅中仙茅苷的含量［J］.中國(guó)藥師，2001，3（4）：220－221.

［7］Fu d x，Lei G Q，Cheng X W，etal.Curculigoside C，a New Phenolic Glucoside fromRhizomes of Curculigo orchioides［J］.Acta Botanica Sinica.2004，4（5）：621－24.

［8］劉振麗，宋志前，孫明杰，等.不同地區(qū)仙茅中仙茅苷含量測(cè)定及酒炙后仙茅苷含量變化［J］.中成藥，2007，29（3）：397－398.

［9］唐正平，李秀蘭，周曉非，等.高效液相色譜法測(cè)定仙茅超微飲片中仙茅苷的含量［J］.湖南中醫(yī)雜志，2002，18（4）：52.

［10］夏念凌.最優(yōu)化問(wèn)題的計(jì)算機(jī)實(shí)用算法［M］.北京：電力出版社，1990：196.