漆 俊，李孝文，田世杰，劉 琪，孫志良，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128;2.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，長沙 410311)

環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CPLX)，又名環(huán)丙氟哌酸、丙氟哌酸、悉復(fù)欣、悉復(fù)歡、適普靈等，常用其鹽酸鹽和乳酸鹽，是目前獸醫(yī)臨床上使用的對革蘭氏陰性菌抗菌活性最強的一種氟喹諾酮類(Fluoroquinolones，F(xiàn)QNs)藥物。其作用機理主要是通過抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶而發(fā)揮其快速殺菌作用，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、支原體等均有很強的抗菌活性。環(huán)丙沙星具有脂溶性高，蛋白結(jié)合率低，抗菌后效應(yīng)(postantibiotic effect，PAE)時間較長，藥物動力學(xué)良好，不良反應(yīng)少，價格低廉等優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床[1-6]。

甲氧芐啶(TMP)，又名磺胺增效劑，是合成抗菌藥，抗菌譜與磺胺藥類似，有強大的抑制二氫葉酸還原酶的作用，但細菌較易對其產(chǎn)生耐藥性，很少單獨使用。臨床上TMP常與磺胺甲噁唑(SMZ)合用治療呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等部位的感染[7]。

為了綜合環(huán)丙沙星和甲氧芐啶的各項優(yōu)點并加以利用，本實驗室采用油乳劑滅活疫苗抗原緩釋技術(shù)與藥用乳劑制備技術(shù)相結(jié)合的方法，以乳酸環(huán)丙沙星為主藥，輔以乳酸甲氧芐啶研制出了復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑。該制劑作為一種長效制劑，穩(wěn)定性好，緩釋效果顯著，可以充分發(fā)揮環(huán)丙沙星高效、長效的優(yōu)點，從而減少臨床用藥次數(shù)。采用家兔對本制劑進行了熱源實驗、紅細胞體外溶血性和肌肉局部刺激性實驗，同時采用豚鼠進行了全身主動過敏性試驗[8-9]，為臨床上安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑(批號:090810，本實驗室與湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心共同研制，每毫升含50 mg乳酸環(huán)丙沙星，10 mg乳酸甲氧芐啶);乳酸環(huán)丙沙星(批號:090622，98.3%，湖南農(nóng)大動物藥業(yè)公司);乳酸甲氧芐啶(乳酸TMP批號:090715，99.1%，湖南農(nóng)大動物藥業(yè)公司);復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(批號:090718，本實驗室自制，每毫升含50 mg乳酸環(huán)丙沙星、10 mg乳酸甲氧芐啶);0.9%氯化鈉注射液(批號:B080412，四川科倫股份有限公司);10%雞蛋清溶液(取新鮮雞蛋蛋清，以生理鹽水稀釋配制)。

1.1.2 儀器設(shè)備 超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備公司);電子天平(AY22O型，日本Electronic Balance公司);電熱恒溫水浴鍋(HHSY11-Ni2型，上海躍進醫(yī)療器械廠);離心機(Z323K型，德國Hermle公司);恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LRH-250-S型，廣東省醫(yī)療器械廠);全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50SⅡ，上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠);電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司)。

1.1.3 試驗動物 健康家兔18只，體重2.5±0.5 kg，雌雄各半;豚鼠18只，體重300±50 g，雌雄各半。所用試驗動物和飼料均由中南大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 熱源性試驗[8]在12只家兔中挑選8只健康家兔?？疾鞓?biāo)準:試驗前在實驗室內(nèi)觀察1周，體重不減輕，精神、食欲及排泄等無異?，F(xiàn)象，雌兔無孕。將所選健康家兔在17～28℃室溫條件下繼續(xù)飼養(yǎng)3 d，給藥前用電子溫度計測定直腸溫度4次(1 h/次)，每次體溫均應(yīng)在38.0～39.6℃之間，據(jù)此挑選出符合要求的家兔3只。測定正常體溫后15 min內(nèi)，將溫?zé)嶂?8℃的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑按0.5 mg/kg劑量后肢肌肉注射，然后進行1 h/次測溫，共測4次，每次在1.5 min內(nèi)完成。

1.2.2 溶血性試驗(體外試管法)[9-13]紅細胞混懸液的制備:選取健康家兔1只，心臟采血20 mL，用玻璃棒攪拌血液除去纖維蛋白，制成脫纖血液。然后將脫纖血液移入刻度離心管內(nèi)，加入其10倍量0.9%氯化鈉注射液，混合后2000 r/min離心10 min，棄去上清液。沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉注射液按上述方法反復(fù)洗滌2～3次，直至上清液呈無色透明為止。將所得紅細胞按其容積用0.9%氯化鈉注射液稀釋成2%的紅細胞混懸液，供后續(xù)試驗用。操作步驟:取潔凈試管7支，編號排列于試管架上。第1～5號管為受試管，第6號管為0.9%氯化鈉注射液對照管(陰性對照管)，第7號管為蒸餾水溶血對照管(陽性對照管)。各試管中各組分加入量如表1所示。按表1依次加入2%紅細胞混懸液、0.9%氯化鈉注射液。將兩者混勻后，置于(37±0.5)℃恒溫箱中30 min;然后分別加入不同量的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑，再搖勻，置(37±0.5)℃的恒溫箱中進行溫育。分別于15、30、45、60、120、180 min觀察實驗結(jié)果，對照表2的判斷標(biāo)準并記錄結(jié)果。

表1 溶血性試驗設(shè)計

結(jié)果判定標(biāo)準:當(dāng)陰性對照管未見溶血和凝集，陽性對照管出現(xiàn)完全溶血，且受試物管的溶液在3 h內(nèi)不發(fā)生溶血和凝集時，表明受試物可以用于注射;若受試物管的溶液在3 h內(nèi)發(fā)生溶血和(或)凝集，則受試物不宜用于注射。溶血性結(jié)果判定標(biāo)準如表2所示。

表2 溶血性結(jié)果判定標(biāo)準

1.2.3 肌肉刺激性試驗[9-13]取健康家兔6只，隨機分為3組，每組雌雄各半。采用兔腿肌肉注射法，于家兔后肢左側(cè)股四頭肌注射0.5 mL/kg的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑，后肢右側(cè)同一部位注射等量的0.9%氯化鈉注射液作同體左右側(cè)自身對比。注射時以30°～45°角度進針為宜。在給藥48 h后，取雌雄各2只由耳靜脈注入空氣處死家兔，剖解取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉組織的反應(yīng)情況，并按表3確定反應(yīng)級數(shù)。剩余2只家兔繼續(xù)觀察14 d，了解刺激性反應(yīng)的可逆程度，必要時進行病理組織學(xué)檢查。

表3 肌肉刺激反應(yīng)分級

結(jié)果判定標(biāo)準:當(dāng)家兔的平均反應(yīng)級數(shù)在2以下者，判斷該注射樣品可作肌肉注射;平均反應(yīng)級數(shù)大于3者，判斷該注射樣品不能供肌肉注射;平均反應(yīng)級數(shù)在2～3級之間者，可進行重復(fù)試驗或結(jié)合其他指標(biāo)綜合考慮。

1.2.4 全身主動過敏性試驗[9-13]取體重為300±50 g的健康豚鼠隨機分為3組，每組6只，雌雄各半。供試組豚鼠腹腔注射復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑，陰性對照組豚鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，陽性對照組腹腔注射1%卵蛋白液。0.5 mL/只，隔日注射，共3次致敏。在末次給藥后10 d，對每組豚鼠以2倍致敏計量的相應(yīng)試劑分別于后腳掌外側(cè)靜脈進行激發(fā)，觀察靜脈注射后各組豚鼠30 min內(nèi)的反應(yīng)及相關(guān)癥狀出現(xiàn)和消失的時間。按全身致敏性評價標(biāo)準進行評價并判斷過敏反應(yīng)發(fā)生程度(表4)。

表4 全身過敏性反應(yīng)評價標(biāo)準表

2 結(jié)果

2.1 熱源性試驗 對家兔注射溫?zé)釓?fù)方環(huán)丙沙星乳劑后，測得體溫數(shù)據(jù)如表5所示。

表5 熱源性試驗結(jié)果 ℃

由表5可見，1～3號家兔給藥前后體溫差分別為0.1℃、0.3℃、0.3℃，均小于0.5℃，且3只家兔體溫升高總和為0.7℃，小于1.4℃，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定[14]。結(jié)果表明，復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑對家兔無熱源反應(yīng)。

2.2 溶血性試驗 分別在 15、30、45、60、120、180 min觀察各支試管，溶血性試驗判斷結(jié)果為:6號管(陰性對照管)無溶血和凝集現(xiàn)象，振搖后均勻分散;7號管(陽性對照管)發(fā)生全溶血;1～5號供試品管在3 h內(nèi)均不發(fā)生溶血和凝集反應(yīng)。結(jié)果表明，復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑對家兔紅細胞無溶血和凝集現(xiàn)象，可供注射使用。

2.3 肌肉刺激性試驗 注射給藥后48 h內(nèi)肉眼觀察，4只家兔注射局部肌肉均未出現(xiàn)紅腫、變性、壞死等嚴重反應(yīng)，個別注射局部肌肉可見輕微充血，但不明顯。處死家兔，切開股四頭肌觀察顯示:0.9%氯化鈉注射液對照組平均反應(yīng)級數(shù)為0.25;供試藥組(復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑)平均反應(yīng)級數(shù)為0.5。0.5遠小于2，表明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑對家兔肌肉注射給藥的局部刺激性很小，可用作肌肉注射。家兔在注射過程中未見全身不良反應(yīng)，剩余2只同樣處理的家兔在恢復(fù)14 d后肌肉狀態(tài)恢復(fù)正常，未見任何病理變化。具體結(jié)果如表6所示。

2.4 全身主動過敏試驗 在末次給藥第10天激發(fā)過敏反應(yīng)后，可見陽性對照組中5只豚鼠出現(xiàn)躁動、豎毛、顫抖、持續(xù)咳嗽、甚至呼吸困難、排尿、步態(tài)不穩(wěn)、痙攣、休克死亡等現(xiàn)象，則判斷其過敏反應(yīng)為極強陽性(++++)，另外1只出現(xiàn)休克死亡之外的所有過敏反應(yīng)，則判斷其過敏反應(yīng)為強陽性(+++)。供試藥組(復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑)和陰性對照組(0.9%氯化鈉注射液)豚鼠則表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)任何過敏反應(yīng)癥狀，則判斷其過敏反應(yīng)為陰性。表明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑無全身主動過敏反應(yīng)，可供臨床注射使用。具體結(jié)果如表7所示。

表7 各組豚鼠全身主動過敏反應(yīng)及其數(shù)量表

3 分析與小結(jié)

環(huán)丙沙星在獸醫(yī)臨床上主要有兩種劑型:可溶性粉和注射液[15]。環(huán)丙沙星除了劑型較少外，單藥環(huán)丙沙星又存在嚴重的耐藥性問題;加之環(huán)丙沙星易溶于水，所以制成口服干乳劑、微乳、亞微乳就比較困難。所以本實驗室研究出了復(fù)方環(huán)丙沙星注射乳劑，目的是為獸醫(yī)臨床提供一種高效、安全、質(zhì)量穩(wěn)定的環(huán)丙沙星新制劑。

復(fù)方是指兩種或兩種以上的藥物混合制劑，可以是中藥、西藥或中西藥混合。這樣處方中出現(xiàn)的各種藥物可以最大程度的發(fā)揮單藥的藥效;同時因為每種成分的用藥量相對減少，還可以減少臨床上耐藥性等問題的發(fā)生。

乳劑(emulsions)是指互不相容的液體組成的非均相分散體系。乳劑由水相(W)、油相(O)和乳化劑組成，三者缺一不可。根據(jù)乳化劑的種類、性質(zhì)及各相體積比形成水包油(O/W)、油包水(W/O)型。也可以制備成復(fù)乳，如O/W/O或W/O/W型。乳劑較非乳劑的優(yōu)點在于:①藥物包被于乳劑內(nèi)相中，可以減少空氣對藥物的污染或氧化，同時，用藥后釋放緩慢，可減低畜禽藥物中毒的幾率;②對于患病畜禽不吃食、不飲水時，注射給藥是比較有效的給藥方式;③對于半衰期短或需要頻繁給藥的藥物，可以減少給藥次數(shù)，藥物可以在體內(nèi)維持較長的時間;④注射緩釋乳劑后，血藥濃度可以長時間維持有效濃度，避免出現(xiàn)峰谷現(xiàn)象，更利于降低藥物的毒副作用，從而更能保證藥物的安全性和有效性;⑤可減少用藥的總劑量，即用較小的劑量就可以達到較好的藥效。

不同的給藥途徑，乳劑的質(zhì)量要求也不相同，很難制定統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準。但是對乳劑的質(zhì)量有一個基本的評定。其中包括:乳劑粒徑大小、穩(wěn)定性、pH 值及通針性等[16]。

在此之前，本實驗室已做了復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑的性狀研究，結(jié)果表明其為淡黃色、油乳狀，pH值在6.3～6.5之間，顆粒評價大小為7.6 μm，穩(wěn)定性和通針性均良好，且體外抗菌效果顯著強于復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(P＜0.01)。所以有必要對該制劑做進一步的安全性考察，以確定其在臨床上的可用性。動物的紅細胞體外溶血性、局部刺激性、熱源反應(yīng)、過敏性及急性毒性反應(yīng)，是新藥臨床前安全性評價的重要組成部分。

通過對復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑進行上述安全性評價試驗，結(jié)果顯示:復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑對家兔肌肉注射給藥不產(chǎn)生熱源反應(yīng);對家兔脫纖紅細胞無體外溶血性或凝集反應(yīng);對家兔后肢肌肉注射給藥不產(chǎn)生明顯的肌肉刺激性反應(yīng);對豚鼠進行腹腔注射也不產(chǎn)生明顯全身過敏性反應(yīng)。由此可見，本實驗室研制的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑可以通過注射給藥達到安全、有效等臨床用藥要求，值得在臨床上推廣應(yīng)用。

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