殷玉和，李瑩瑩，劉新濤，吳叢梅

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012)

犬干擾素α(CaIFN-α)具有廣譜抗病毒活性，可治療犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱等高致死性病毒病[1]。2009年陳紅英等[2]利用PCR技術(shù)從藏獒犬肝臟基因組DNA中擴(kuò)增了犬干擾素α全基因，并對(duì)該基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序。2010年項(xiàng)黎麗等[3]克隆、表達(dá)了 CaIFN-α，目的蛋白表達(dá)量約為20%。目前還沒(méi)有關(guān)于CaIFN-α大規(guī)模生產(chǎn)工藝的系統(tǒng)性研究報(bào)道。本文對(duì)CaIFN-α序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并設(shè)計(jì)合成編碼CaIFN-α的基因片段，著重對(duì)CaIFN-α包涵體的破碎，CaIFN-α蛋白的變性、復(fù)性及純化的方法進(jìn)行了研究，從而優(yōu)化CaIFN-α大規(guī)模生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌E．coli BL21和表達(dá)載體pBV220均為本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ為英國(guó)NEB公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA快速回收試劑盒為德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品;MDCK(犬腎細(xì)胞)、VSV(水皰性口炎)病毒為實(shí)驗(yàn)室保存;AKTA explorer100蛋白純化系統(tǒng)(GE Healthcare);發(fā)酵罐(BioFlo5000)。

1.2 方法

1.2.1 CaIFN-α基因片段的合成 參照Genbank中CaIFN-α基因序列，使用Codon Usage Database分析大腸桿菌使用密碼子偏好性，在不改變氨基酸序列的前提下，替換了除構(gòu)成mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)密碼子外的利用率低于15%的密碼子，對(duì)密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，并由上海生物工程有限公司合成，得到優(yōu)化的CaIFN-α基因片段。

1.2.2 構(gòu)建pBV220-CaIFN-α重組表達(dá)質(zhì)粒將pBV220溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體，用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，切下表達(dá)載體片段進(jìn)行膠回收，用T4連接酶連接合成的CaIFN-α基因片段與pBV220表達(dá)載體，構(gòu)建 pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，證實(shí)構(gòu)建正確。

1.2.3 重組質(zhì)粒pBV220-CaIFN-α的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pBV220-CaIFN-α轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E．coli BL21，按1%接種量將E．coli BL21工程菌接種于200 mL含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物按5%接種量接種于1 L含氨芐青霉素(50 μg/mL)LB培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)。至 OD600=0.6時(shí)，將二代培養(yǎng)物按10%接種量接種于40 L發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)，至OD600=1～2時(shí)，快速升溫至42℃，菌體表達(dá)，過(guò)程中適量添加補(bǔ)料(30%葡萄糖)，控制pH值為7，培養(yǎng)5 h，4000 r/min離心30 min，收集表達(dá)菌體，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 CaIFN-α包涵體的制備 將發(fā)酵收集菌體按1∶10懸浮于TE緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎30 min(超聲儀頻率20 kHz，超聲5 s，間隔5 s)，鏡檢，菌體破碎率90%停止破碎，10000 r/min離心15 min，棄上清，即得CaIFN-α包涵體粗品。

1.2.5 CaIFN-α包涵體的洗滌、變性及復(fù)性 將CaIFN-α包涵體粗品按1∶5懸浮于4 mol/L尿素(pH=8.5)中，吹打均勻，10000 r/min離心15 min，棄上清，收集沉淀;將沉淀按1∶5溶于7 mol/L鹽酸胍(pH=11)中，混合均勻，裂解作用2～3 h，10000 r/min離心15 min，收集上清，得 CaIFN-α包涵體的溶解液;將包涵體溶解液用2.5 mol/L鹽酸胍(pH=11)按1∶3稀釋后，按1∶8加入到0.15 mol/L硼酸溶液(pH=9.6)中，4℃復(fù)性作用18 h后，得到復(fù)性液。

1.2.6 CaIFN-α目的蛋白疏水層析 在復(fù)性液中加入(NH4)2SO4至終濃度為1.5 mol/L，上載疏水層析(HIC)柱，柱料為 Phenyl Sepharose 6FF(LS)，平衡液為50 mmol/L PB、1.5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8)，洗脫液為 50 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8)，利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)控制，收集洗脫蛋白樣品。樣品進(jìn)行SDSPAGE純度檢測(cè)，Lowry法測(cè)定蛋白濃度，鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素。再生液為0.5 mol/L NaOH，再生色譜柱。

1.2.7 CaIFN-α目的蛋白分子篩層析 將上述收集樣品上載分子篩層析(Sephacryl-S-100)，洗脫液為20 mmol/L PB、0.85%NaCl(pH 7.4)，利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)控制，收集洗脫蛋白樣品。樣品進(jìn)行SDS-PAGE純度檢測(cè)，Lowry法測(cè)定目的蛋白濃度，鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素。再生液為0.1 mol/L NaOH，再生色譜柱。

1.2.8 CaIFN-α活性測(cè)定 采用細(xì)胞病變抑制法[4-5]，依據(jù)抑制 VSV(水皰性口炎)病毒攻擊MDCK(犬腎細(xì)胞)細(xì)胞病變的方法，測(cè)定重組犬干擾素的活性。將MDCK接種于96孔板，5%CO2、37℃培養(yǎng)為單層，加倍比稀釋的重組犬干擾素作用24 h，每孔再加入含100 TCID50的VSV病毒，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照和空白對(duì)照組，24 h后用結(jié)晶紫染液染色細(xì)胞，酶標(biāo)儀上檢測(cè)測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm，參比波長(zhǎng)為630 nm，經(jīng)SOFT max PRO軟件分析輸入稀釋倍數(shù)后，以標(biāo)準(zhǔn)品校正生物活性值。

1.2.9 制備三批CaIFN-α蛋白 按上述工藝制備三批CaIFN-α蛋白，記錄不同批次CaIFN-α蛋白的質(zhì)量檢測(cè)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 CaIFN-α目的基因片段的合成 經(jīng)密碼子優(yōu)化得到的CaIFN-α基因，由上海生物工程有限公司合成。瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察鑒定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，CaIFN-α基因大小約為510 bp，與理論大小相符。

2.2 pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒的酶切鑒定pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，有明顯的pBV220表達(dá)載體條帶和CaIFN-α基因條帶，說(shuō)明pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，結(jié)果如圖2所示。

2.3 pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果鑒定 誘導(dǎo)條件:30℃培養(yǎng)，升溫42℃誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后每隔1 h取樣1次，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)后在18000處出現(xiàn)明顯CaIFN-α蛋白條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒有表達(dá)。隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，CaIFN-α蛋白表達(dá)量增大，誘導(dǎo)5 h CaIFN-α蛋白表達(dá)效果最佳，蛋白表達(dá)量(目的蛋白與總蛋白的百分比)為25%。

2.4 pBV220-CaIFN-α包涵體破碎、變性及復(fù)性表達(dá)菌體經(jīng)過(guò)超聲破碎得到包涵體，再經(jīng)7 mol/L鹽酸胍變性和0.15 mol/L硼酸復(fù)性作用后，可得到初步純化的CaIFN-α蛋白。復(fù)性后CaIFN-α蛋白SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖4所示，在18000處出現(xiàn)明顯CaIFN-α蛋白條帶。

2.5 CaIFN-α目的蛋白疏水層析 樣品用50 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8)洗脫液，經(jīng)疏水層析柱純化，圖5為AKTA蛋白純化系統(tǒng)紫外檢測(cè)記錄，洗脫峰為CaIFN-α蛋白峰。圖6為疏水層析純化后樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，在相對(duì)分子質(zhì)量18000處出現(xiàn)一條明顯的特異性蛋白條帶。

2.6 CaIFN-α目的蛋白分子篩層析 收集的洗脫樣品用20 mmol/L PB、0.85%NaCl(pH 7.4)洗脫液，經(jīng)分子篩層析柱純化，圖7為AKTA蛋白純化系統(tǒng)紫外檢測(cè)記錄，洗脫峰為CaIFN-α蛋白峰，純度較高。圖8為分子篩層析純化后樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，在相對(duì)分子質(zhì)量18000處出現(xiàn)一條明顯的特異性蛋白條帶，且?guī)缀鯖](méi)有其他雜蛋白條帶。

2.7 制備工藝各步驟質(zhì)量檢測(cè) 表1中顯示為包涵體復(fù)性、疏水層析和分子篩層析三個(gè)純化步驟的質(zhì)量檢測(cè)數(shù)據(jù)，總產(chǎn)率為20%。

2.8 不同批次制備CaIFN-α的質(zhì)量檢測(cè) 如表2所示，制備的三批CaIFN-α質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明，CaIFN-α純度均≥96%，產(chǎn)率均≥20%，內(nèi)毒素均≤10 EU/mg，且都具有較好的生物活性，說(shuō)明本制備工藝穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。

圖7 分子篩層析的紫外檢測(cè)

圖8 CaIFN-α純化蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜

表1 不同純化步驟質(zhì)量檢測(cè)

表2 不同批次CaIFN-α的質(zhì)量檢測(cè)

3 討論

本研究使用Codon Usage Database對(duì)大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行了分析[6-7]，在不改變氨基酸序列的前提下，將低利用率的稀有密碼子替換為表達(dá)菌常用的密碼子，對(duì)CaIFN-α基因進(jìn)行了優(yōu)化改造，提高了CaIFN-α基因的表達(dá)水平。選擇將CaIFN-α基因與pBV220溫控型原核高效表達(dá)載體[8]連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E．coli BL21，培養(yǎng)時(shí)間為4 h，升溫誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為5 h，整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)周期較短，且表達(dá)體系具有抗污染能力強(qiáng)的特點(diǎn)[9]。

由于疏水層析介質(zhì)具有疏水性弱的特點(diǎn)[10]，并以高鹽的水溶液作為流動(dòng)相，使得與蛋白質(zhì)的作用過(guò)程比較溫和。CaIFN-α蛋白以包涵體形式存在，具有較強(qiáng)的疏水性，所以本研究選用疏水層析的方法進(jìn)行純化，可以更好保持CaIFN-α蛋白的天然結(jié)構(gòu)和生物活性。疏水層析純化的CaIFN-α樣品上載分子篩層析柱進(jìn)一步純化，可以實(shí)現(xiàn)更替CaIFN-α樣品緩沖液的目的。分子篩層析純化得到的CaIFN-α樣品緩沖液為對(duì)動(dòng)物體無(wú)害的磷酸鹽體系，便于目的CaIFN-α蛋白的進(jìn)一步制劑應(yīng)用。

采用上述生產(chǎn)工藝制備了三批CaIFN-α蛋白，計(jì)算其總產(chǎn)率均≥20%，目前所報(bào)道的CaIFN-α產(chǎn)率為13.75%[11]，與之相比產(chǎn)率有所提高。工藝中采用常規(guī)蛋白質(zhì)色譜分離方法和常見(jiàn)的無(wú)機(jī)鹽試劑，使得制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行且更為安全。質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明該CaIFN-α生產(chǎn)工藝適合大規(guī)模生產(chǎn)，且具有收率高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

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