張麗萍 毛晶晶 刁靜靜 王 雪

麥胚蛋白水解物抗氧化活性及其作用模式

張麗萍1，2毛晶晶2刁靜靜1王 雪2

(黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心1，大慶 163319)
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2，大慶 163319)

采用中性蛋白酶水解麥胚蛋白0．5～6 h，測定水解物的DH(degree of hydrolysis)、硫代巴比妥酸值(TBARS值)、POV值(Prroxide value)、Cu2+螯合能力、二苯代苦味肼基自由基清除能力(DPPH自由基)。結(jié)果表明，麥胚蛋白水解度隨著水解時(shí)間的延長而增加;水解物5 h與未水解的蛋白及0．02%VC相比，在大豆卵磷脂脂質(zhì)氧化體系(Liposome體系)中具有較強(qiáng)的抑制脂質(zhì)氧化的能力，還具有較強(qiáng)的Cu2+螯合能力和清除自由基能力，未水解的蛋白具有較弱的抗氧化能力;通過對未水解的麥胚蛋白及不同濃度蛋白水解物的抗氧化指標(biāo)測定和分析，認(rèn)為水解物的抗氧化活性與蛋白本身的結(jié)構(gòu)、肽鏈長短及氨基酸殘基有關(guān)。

麥胚蛋白 水解 抗氧化活性

小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一，年產(chǎn)量在1億噸以上［1］。麥胚是小麥加工的副產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%以上，而且麥胚蛋白是一種完全蛋白，含有人體必需的8種氨基酸［2］，還蘊(yùn)含著許多具有生物活性的氨基酸序列。肽類尤其是一些小分子肽不僅有比蛋白質(zhì)更好的消化吸收性能，還具有諸如對人體的生理調(diào)節(jié)和防病抗病的生理機(jī)能，如乳清蛋白［3］、牛乳酪蛋白［4］、魚蛋白［5］、蛋黃蛋白［6］、豬肉蛋白［7］、膠原蛋白［8］、大豆蛋白［9］等蛋白的水解物。目前對于麥胚生物活性肽的研究已經(jīng)很多，Toshiro等［10］對脫脂麥胚先后進(jìn)行了3%α－淀粉酶酶解3 h及0．5%堿性蛋白酶酶解8 h，酶解物經(jīng)YMCAODS、AG50W－X8陽離子交換及HPLC分離純化后得到了16種2～7個(gè)氨基酸殘基的降血壓活性肽。辛志宏等［11］用堿性蛋白酶水解小麥胚芽蛋白得到的水解物對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶也有較強(qiáng)的抑制活性，水解物經(jīng)Sephadex G－15純化、制備RP－HPLC分離，得到一種對ACE有強(qiáng)烈抑制作用的組分，其序列為Ala－Met－Tyr。程云輝等［12］對麥胚抗氧化肽水解用酶進(jìn)行了篩選，最終得出堿性蛋白酶Proleather FG－F是制備麥胚抗氧化肽的最適水解酶。綜上所述，對于麥胚蛋白水解物抗氧化和降血壓活性研究的較多，但是對于麥胚蛋白水解物抗氧化活性的機(jī)理探討很少。

本研究對不同濃度的麥胚蛋白水解物進(jìn)行硫代巴比妥酸反應(yīng)物值(TBARS值)、過氧化物值(POV值)、Cu2+螯合能力、DPPH自由基清除能力進(jìn)行了測定，探討了麥胚蛋白水解物的抗氧化機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

麥胚蛋白:北大荒豐緣麥業(yè)有限責(zé)任公司;中性蛋白酶(60 000 U/g):NOVO公司;大豆卵磷脂、抗壞血酸鈉、二苯代苦味肼基自由基(DPPH):Sigma公司;抗壞血酸(VC)、組氨酸:北京索萊寶科技有限公司;硫酸銅、吡啶、硫代巴比妥酸、氯仿:均為分析純，大慶市隆寬試劑有限公司。

DK－S24型電熱恒溫水浴鍋:上海森信試驗(yàn)儀器有限公司;DELTA320型pH計(jì):梅特勒－托利多儀器有限公司;AR2140電子天平:奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司;LD4－1．8臺(tái)式離心機(jī):北京京立離心機(jī)有限公司;JJ－1精密增力電動(dòng)攪拌器:江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1．2 方法

1．2．1 麥胚蛋白的制備

首先采用正己烷去除麥胚中的小麥胚芽油，將脫脂后的小麥胚芽用粉碎機(jī)粉碎過后過100目篩，稱取50 g小麥胚芽粉加入500 mL蒸餾水，稱5 g NaCl用少量水溶解后加入上述溶液中，調(diào)至pH 9．0，用磁力攪拌器攪拌30 min，再于5 000 r/min離心10 min，取上清液，在水浴鍋中保溫至65℃，調(diào)至pH 6．3，加入0．3%的α－淀粉酶，水解3 h，調(diào)至pH 4．0，待沉淀完全后，二次離心10 min，取沉淀，用蒸餾水溶解并調(diào)至pH 7．0，透析脫鹽，干燥備用［11］。所提蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%。

1．2．2 麥胚蛋白水解物的制備

將麥胚蛋白與適量的水混合，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、5%和8%的樣品溶液，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH 7．0，加人一定量的中性蛋白酶，于50℃水浴下振蕩水解，反應(yīng)過程中不斷加入1 mol/L的NaOH，使pH保持恒定，記錄耗堿量，用于計(jì)算水解度。待水解結(jié)束后在攪拌條件下迅速升溫至95℃，保持10 min使酶滅活。

1．2．3 水解度的測定(degree of hydrolysis，DH)

水解度的測定采用pH－Stat法［13］，水解度的計(jì)算公式按下式計(jì)算:

式中:h為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量/mmol/g;htot為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量/mmol/g，麥胚蛋白htot=8．3 mmol/g;V為水解過程中所消耗的堿量/mL;cb為堿液的濃度/mol/L;m為水解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g;1/α為校正系數(shù)，中性蛋白酶的1/α=1．40。

1．2．4 大豆卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的制備

為了研究麥胚蛋白水解的抗氧化性能，用大豆卵磷脂脂質(zhì)氧化體系模擬脂肪氧化體系，其制備方法參照Decker等［14］的方法，稍作修改。稱取一定量的大豆卵磷脂溶于0．12 mol/L KCl，0．005 mol/L組氨酸緩沖溶液(pH 6．8)中，制成含有2 mg/mL卵磷脂的溶液，均質(zhì)，并用超聲波在4℃下超聲處理45 min。然后取5 mL的卵磷脂脂質(zhì)體，加入1 mL麥胚蛋白水解物，向脂質(zhì)體和蛋白水解液的混合物中加入0．1 mL 0．05 mol/L FeCl3和0．1 mL 0．01 mol/L抗壞血酸鈉引發(fā)脂質(zhì)氧化，然后將樣品放在37℃水浴中保溫1 h，通過測定TBARS值脂肪氧化情況。

1．2．5 TBARS值的測定

參照Sinnhuber等［16］的方法，做適當(dāng)?shù)男薷?。? mL樣品加入2 mol/L 3 mL硫代巴比妥酸溶液、20 mmol/L 17 mL三氯乙酸 － 鹽酸溶液，混勻后，沸水浴中反應(yīng)30 min，冷卻，取5 mL樣品加入等體積的氯仿，3 000 r/min下離心10 min，532 nm下讀取吸光值。TBARS值以每升脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛

式中:A532為溶液的吸光值;Vs為樣品的體積;9．48為常數(shù)。

1．2．6 POV值的測定

參照Kong［16］的方法，1 mL的Liposome樣品與10 mL的醋酸/氯仿(3∶2)混合，混勻后加入0．3 mL飽和碘化鉀，搖勻，加入30 mL蒸餾水和0．3 mL的0．1%的淀粉指示劑。用2 mmol/L硫代硫酸鈉滴定，直到藍(lán)色消失。沒加Liposome的作為空白。計(jì)算公式如下:

式中:S為滴定樣品所消耗的硫代硫酸鈉/mL;V為滴定空白樣品所消耗的硫代硫酸鈉/mL;C為硫代硫酸鈉的濃度/mmol/L;Vs為樣品的量/mL。

1．2．7 Cu2+螯合能力

參照Wang［17］等的方法，用鄰苯二酚紫(PV)作為金屬螯合指示劑。向1 mL 2 mmol/L的CuSO4溶液、1 mL 10%的吡啶與20μL 10%的PV混合物中添加1 mL的麥胚蛋白水解物，PV與CuSO4結(jié)合形成藍(lán)色物質(zhì)，在有螯合劑存在時(shí)PV與Cu2+離子分離，溶液藍(lán)色消失。PV溶液顏色的變化可以在632 nm處測量。

麥胚蛋白水解物對金屬離子的螯合作用可按下式計(jì):

螯合作用=［1－(A樣品/A空白)］×100%

1．2．8 DPPH自由基清除能力

參照Zhang等［18］的方法，稍作修改。取樣品溶液2 mL加入2 mL 0．1 mmol/L的DPPH溶液，用2 mL 95%乙醇溶解0．1 mmol/L DPPH作為對照，在室溫下避光反應(yīng)30 min，測定517 nm的吸光值，同時(shí)以乙醇為空白，所有測定值均為3次平均值，DPPH自由基清除率按下式計(jì)算:

DPPH·抑制率=［1－(A樣品/A對照)］×100%

1．2．9 統(tǒng)計(jì)分析

采用Sigmaplot 9．0軟件作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Statistix 8．1軟件中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性(P＜0．05)，分析使用Turkey HSD程序。試驗(yàn)結(jié)果均為3次測定結(jié)果的平均值。的毫克數(shù)數(shù)表示。計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2．1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解度

圖1反映的是不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解度，通常用水解度DH來反映蛋白質(zhì)酶解過程中肽鍵的斷裂程度［12］。從圖1可知，水解度隨著水解時(shí)間的延長而增加，到6 h時(shí)，2%，5%和8%麥胚蛋白的水解度分別達(dá)到了18．3%，18．01%和15．4%。水解初期水解度迅速增加，到5 h后水解度增加不顯著(P＞0．05)。而且水解度隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，在反應(yīng)初期，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解度差異顯著(P＜0．05)，尤其是0．5～3 h之間，到了4 h后，2%和5%之間的水解度差異不顯著(P＞0．05)，這可能是由于蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加使得酶與底物之間的作用范圍變大的結(jié)果［15］。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解產(chǎn)物的水解度

2．2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解產(chǎn)物對Liposome脂質(zhì)氧化體系的抑制能力

圖2是不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解產(chǎn)物對脂質(zhì)氧化體系抑制能力的測定結(jié)果。從圖2可知，麥胚蛋白水解物在Liposome脂質(zhì)體系中的抑制能力隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，而且隨著水解時(shí)間的延長，水解物的抑制能力逐漸增強(qiáng)，其中在5 h時(shí)的抑制能力達(dá)到最強(qiáng)，與未水解蛋白的TBARS值相比較，差異顯著(P＜0．05)，其抗氧化能力也明顯強(qiáng)于0．02%VC的(P＜0．05)。Hirose等［19］研究中假設(shè)蛋白水解物可以在脂質(zhì)粒的外邊形成一層保護(hù)膜使其不被氧化，所以麥胚蛋白之所以具有抗氧化能力，可能是由于麥胚蛋白水解后一些兩性的、有活性的小肽，以及一些麥胚蛋白殘基容易擴(kuò)散在水－油體系的外邊，這些物質(zhì)可以吸收或者是與Liposome體系中的磷脂膜緊密結(jié)合，從而達(dá)到抗氧化的能力。在6 h時(shí)的抑制能力有所減弱，這是因?yàn)榻?jīng)過長時(shí)間水解，蛋白質(zhì)分解成更小分子的肽，這些小肽不足以包裹Liposome體系中的磷脂膜，從而影響抗氧化效果。8%水解物的抗氧化能力比2%的水解產(chǎn)物強(qiáng)，與5%水解物的抗氧化能力差異不顯著(P＞0．05)。這是由于隨著底物濃度的增加，酶與底物充分接觸，肽鍵斷裂的多，得到的具有抗氧化性的小肽相對比較多，而隨著底物濃度的繼續(xù)加大，酶與底物之間的結(jié)合達(dá)到相對平衡［20］。通過TBARS值指標(biāo)的測定得出5%的麥胚蛋白在5 h時(shí)的水解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解產(chǎn)物對脂質(zhì)氧化體系的抑制能力

2．3 POV值的測定

圖3是不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解產(chǎn)物對卵磷脂體系中POV值的測定結(jié)果。由圖3可知麥胚蛋白水解物在Liposome體系中的POV值隨著水解物的水解時(shí)間呈明顯的降低趨勢(P＜0．05)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加POV值顯著降低(P＜0．05)，與0．02%VC相比，0．5 h后的水解產(chǎn)物的POV值都顯著低于VC的，這就說明麥胚蛋白水解物具有顯著的抗氧化能力，從圖3中也可以看出5 h的水解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，8%麥胚蛋白的水解產(chǎn)物與5%麥胚蛋白的水解產(chǎn)物相比，抗氧化能力差異不顯著(P＞0．05)，與2%的麥胚蛋白的水解產(chǎn)物相比差異顯著(P＜0．05)，檢測結(jié)果與以上的TBARS值的測定結(jié)果一致。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解產(chǎn)物對POV值的影響

2．4 Cu2+螯合能力

圖4是不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白水解物對Cu2+螯合能力的測定結(jié)果。由圖4可以看出，麥胚蛋白水解物具有Cu2+螯合能力，未水解的麥胚蛋白基本上不具有銅離子螯合能力，到5 h時(shí)，5%的水解物的螯合能力達(dá)到了57%，顯著高于0．02%VC(Cu2+螯合能力為18%)。而且銅離子螯合能力隨著水解時(shí)間的延長呈遞增的趨勢，隨著底物濃度的增加而增強(qiáng)，5%和8%的麥胚蛋白水解物金屬螯合能力差異不顯著(P＞0．05)，到6 h時(shí)，金屬離子的螯合能力明顯降低(P＜0．05)。研究表明肽的螯合能力與他的抗氧化能力有關(guān)［21］，這是由于隨著水解時(shí)間的延長，濃度的增加，肽鏈的斷裂增加了羧基的含量，提高了Cu2+與羧基的結(jié)合，進(jìn)而消除了脂質(zhì)體系中的游離Cu2+離子。

2．5 DPPH自由基清除能力

圖5是不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白在不同水解時(shí)間下的水解產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果。麥胚蛋白水解物的清除自由基能力以測定DPPH·清除能力為指標(biāo)，DPPH·是穩(wěn)定的基團(tuán)，并且反應(yīng)程度取決于抗氧化劑的供氫能力，反應(yīng)溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色，這表明麥胚蛋白水解物具有DPPH自由基清除能力。由圖5可以看出，DPPH·清除能力從0．5 h后顯著增加(P＜0．05)，到5 h時(shí)，2%、5%和8%麥胚蛋白的水解產(chǎn)物的清除能力從0 h(0 h水解產(chǎn)物即未水解的麥胚蛋白)的19%、23%和25%分別達(dá)到了57%、61%和67%，這就說明未水解麥胚蛋白也具有一定的抗氧化活性。3 h開始到5 h，水解物的自由基清除能力差異不顯著，與0．02%VC相比差異不顯著(P＞0．05)。到6 h時(shí)，水解物的自由基清除能力又有所降低，這可能由于肽分解成更小分子質(zhì)量的肽或者是游離氨基酸，減少了其作為氫供體的極性。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白水解物的DPPH自由基清除能力

2．6 討論

蛋白多肽的抗氧化活性受很多因素的影響，水解物所表現(xiàn)出的抗氧化作用包含復(fù)雜的反應(yīng)機(jī)制，除了能在油脂外層形成包膜外，還包含了電子/氫供體、自由基清除、及金屬離子螯合等其他抗氧化機(jī)制。圖6是麥胚蛋白水解物抗氧化機(jī)制的一個(gè)模型［16］，麥胚蛋白水解物具有抗氧化能力與其自身的蛋白結(jié)構(gòu)也有很大關(guān)系，尤其是麥胚蛋白含有谷胱甘肽(GSH)，谷胱甘肽是一種具有生物活性的天然三肽，在麥胚中的含量為98～107 mg/g［22］。未水解的麥胚蛋白由于其結(jié)構(gòu)緊密而抗氧化能力比較小，通過中性酶水解后打破了麥胚蛋白的緊密結(jié)構(gòu)，從而形成了一個(gè)開放的、暴露的氨基酸殘基，可與氧化物反應(yīng)。

圖6 麥胚蛋白水解物抗氧化反應(yīng)機(jī)制

通過圖1和圖2也可以看出，蛋白的水解度與抗氧化能力不呈正相關(guān)，而是與其在一定水解度條件下形成的特定結(jié)構(gòu)有關(guān)(如肽鏈的長度、不同游離氨基酸的比例等等)，Kong等［16］認(rèn)為水解打破了蛋白本身的緊密結(jié)構(gòu)，使氨基酸殘基充分暴露出來，圍繞在脂肪球表面以防止其被氧化。水解后的小肽可更好的吸附或松散的結(jié)合到發(fā)生氧化作用脂質(zhì)的磷脂膜表面，更好的擴(kuò)散到水油界面起到抗脂質(zhì)氧化的作用;同理，作為保護(hù)膜，小肽的蛋白結(jié)構(gòu)必須具有一定的完整性，過度的水解可能會(huì)降低肽的穩(wěn)定性，同時(shí)，小肽作為阻止自由基進(jìn)入脂質(zhì)中脂相的物理屏障作用也會(huì)降低［16，20］。這就解釋了為什么在一定水解度條件下抗氧化能力較強(qiáng)的原因。

過渡期的金屬元素Cu2+能催化氧化反應(yīng)的發(fā)生，如羥自由基(·OH)和超氧自由基(O2·－)以及不飽和脂肪的氧化［23－24］。肽具有螯合能力可能是由于隨著水解時(shí)間的延長，濃度的增加，肽鏈的斷裂增加了羧基的含量，提高了Cu2+與羧基的結(jié)合，進(jìn)而消除了Liposome體系中的游離金屬離子［16］，而本研究結(jié)論證實(shí)了這一假設(shè)。Chen等［25］的研究顯示大豆蛋白水解物的抗氧化能力與蛋白酶水解后的肽鏈中氨基酸的排列順序及某些特殊氨基酸殘基有關(guān)。

油脂的氧化是脂肪酸在和空氣中的氧在室溫下，未經(jīng)任何直接光照，未加任何添加劑等條件下的完全自發(fā)的氧化反應(yīng)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其中間狀態(tài)及初級(jí)產(chǎn)物又能加快其反應(yīng)速度，故又成為自動(dòng)催化氧化。即RH(脂肪酸)經(jīng)氧化反應(yīng)形成R·，麥胚蛋白水解物的抗氧化機(jī)理在于水解后形成的麥胚蛋白殘基—COOH中的H作為供體與脂肪酸氧化后的R·相互結(jié)合，形成新的RH，水解后的兩個(gè)麥胚蛋白殘基相互結(jié)合，從而達(dá)到阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生［26］。

3 結(jié)論

本研究通過對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)麥胚蛋白的水解產(chǎn)物的DH、TBARS值、Cu2+螯合能力及DPPH自由基清除能力等體外活性指標(biāo)進(jìn)行測定，確定了麥胚蛋白水解物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力比0．02%VC強(qiáng)，而且對各個(gè)測定指標(biāo)進(jìn)行分析，對麥胚蛋白水解物的抗氧化機(jī)有了大致的了解，但對于其體內(nèi)活性的測定還有待于進(jìn)一步研究。從所測定的抗氧化指標(biāo)綜合來看，中性蛋白酶水解底物濃度為5%的麥胚蛋白，水解產(chǎn)物的TBARS值達(dá)到了0．27 mg/L左右，說明水解物具有較高的抗氧化活性，而且具有BHA、BHT等抗氧化劑所不具有的Cu2+螯合能力;DPPH自由基清除能力達(dá)到了60%。

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Study on Antioxidant and Mechanism of Wheat Germ Hydrolysates

Zhang Liping1，2Mao Jingjing2Diao Jingjing1Wang Xue2
(Agri－ F ood processing Development centre of Heilongjiang1，Daqing 163319)
(College of Food Science，Heilongjiang August First Land Reclamation university2，Daqing 163319)

Wheat germ protein was hydrolyzed for 0．5～6 h by neutral protease，and degree of hydrolysis(DH)increased with hydrolysis time．Wheat germ protein hydrolysates's DH，Thiobarbituric acid－reactive substance values，peroxide，Cu2+chelation ability and radical－scavenging ability were mensurated．The result demonstrated that neutral protease－h(huán)ydrolyzed wheat germ protein exhibited a stronger antioxidant activity than non－h(huán)ydrolyzed protein and 0．02%VC，as indicated by peroxide and TBARSvalues in a liposome－oxidizing system．And possess strong Cu2+chelation ability and radical－scavenging ability．Antioxidant mechanism of hydrolysates was analyzed，as what antioxidant index of non－h(huán)ydrolyzed wheat germ protein and hydrolysates with different concentration were mensurated．The antioxidant effectiveness of the protein hydrolysates appeared to depend on specific structure，type of peptides，and ratio of different freed amino acids．

wheat germ protein，hydrolysis，antioxidant activity

TQ936．1

A

1003－0174(2012)06－0014－06

黑龍江省科技攻關(guān)計(jì)劃(NB08B004)

2011－04－07

張麗萍，女，1957年出生，教授，博士生導(dǎo)師，食品科學(xué)