溫針灸對嗎啡戒斷大鼠NR2B受體表達影響的研究*

衛(wèi) 哲，董 哲，孫遠征，尚 穎

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.哈爾濱市兒童醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150010)

目前，嗎啡依賴和戒斷的機制已成為國內(nèi)外眾多學(xué)者研究的熱點和難點。藥物反復(fù)濫用會影響機體學(xué)習(xí)記憶能力，NR2B作為NMDA受體的主要亞基之一，其高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠具有超常的學(xué)習(xí)記憶能力，在行為學(xué)測試中表現(xiàn)出良好的學(xué)習(xí)記憶能力，有學(xué)者認(rèn)為NR2B與大腦的認(rèn)知密切相關(guān)，從而將NR2B命名為“聰明基因”[1]。而NR2B蛋白在嗎啡和自然獎賞條件位置偏愛的學(xué)習(xí)中亦發(fā)揮著重要作用[2]。研究表明，藥物成癮的慢性過程可以導(dǎo)致腦功能的長時程變化，引起中樞突觸可塑性的變化，多種學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)參與其中，多巴胺、谷氨酸等相對獨立又互相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)共同參與成癮行為的學(xué)習(xí)記憶調(diào)控過程，對記憶產(chǎn)生正向或反向的影響，調(diào)節(jié)著記憶的鞏固。本研究通過溫針灸對NR2B受體表達的影響，從而分析嗎啡戒斷后大鼠的空間學(xué)習(xí)能力的中樞作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

選擇由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供的雄性SD大鼠40只，體重為(190±30)g。實驗前進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，房間溫度、濕度分別在 22℃、75%左右。

1.2 實驗試劑

兔抗多克隆一抗(武漢博士德生物工程有限公司);二抗PV6001(北京中山生物工程有限公司);鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠)。

1.3 主要儀器與設(shè)備

MT－200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)、KWD808Ⅱ脈沖治療儀、moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)等。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

采用transform隨機分組方法，將40只大鼠分為對照組、模型組、手針組、溫針灸組，每組各10只。

2.2 造模方法

對模型組、手針組、溫針灸組大鼠均采用逐日遞增法背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液，5天的劑量分別為(20 mg/kg，30 mg/kg，40 mg/kg，50 mg/kg，50 mg/kg)，2次/天(8 am，4 pm)。對照組以相同劑量、相同時間注射生理鹽水。嗎啡末次注射后3 h給予納絡(luò)酮腹腔注射(3 mg/kg)快速戒斷，隨即將大鼠置于3000 ml燒杯中，觀察10 min內(nèi)大鼠的跳躍、舔陰、豎立、濕抖、洗臉等戒斷反應(yīng)，建立嗎啡依賴戒斷大鼠模型[3～4]。評分標(biāo)準(zhǔn)見表 1。

表1 戒斷癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 各組處理

對照組:第6天開始同溫針灸組以相同方法固定。

模型組:按上述方法造模，第6天開始同溫針灸組以相同方法固定。

溫針灸組:第6天開始予溫針灸治療，取百會、雙側(cè)腎俞，針刺得氣后，在針尾上搓捏少許艾絨點燃施灸，只待燃盡，除去灰燼，留針稍許再將針拔出，共計留針15 min，連續(xù)6天。

手針組:第6天開始予針刺治療，選穴方法同溫針灸組，15次/min，1次/天，連續(xù)6天。

2.4 灌注取材

治療結(jié)束后各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉后開胸，于右心房和左心室心尖部各做一切口，進行主動脈插管快速灌注沖洗液 200 ～250 ml[5]，開顱，完整取出全腦組織，分離Nac腦區(qū)，液氮保存。

2.5 免疫組化PV二步法

①切片常規(guī)脫蠟到水; ②3% H2O2中孵育10 min，PBS 沖洗2 min3 次; ③微波修復(fù); ④滴加一抗，4℃冰箱中過夜，PBS 沖洗2 min3 次; ⑤滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS 沖洗2 min3 次; ⑥D(zhuǎn)AB 顯色5 ～ 10 min，蒸餾水充分沖洗; ⑦蘇木素復(fù)染1 min; ⑧常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.6 結(jié)果觀察方法

moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)于400倍視野下攝影，每組隨機選取10個視野，用Motic image 3.2圖像分析軟件進行分析，計算平均光密度。陽性表達呈黃色或棕黃色。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

由SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 嗎啡戒斷大鼠行為學(xué)觀察

大鼠戒斷癥狀評分，見表2。表2結(jié)果顯示，除對照組外，模型組、溫針灸組、手針組大鼠經(jīng)快速戒斷后出現(xiàn)站立、激惹、齒顫等一系列戒斷癥狀，戒斷癥狀的評分值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明動物模型建立成功。

表2 嗎啡戒斷大鼠癥狀觀察(±s)

表2 嗎啡戒斷大鼠癥狀觀察(±s)

注:與對照組相比，△P ＜0.05。

0.3 ±0.48模型組 20.5 ±4.16△溫針灸組 18.5 ±3.78△手針組 21.41 ±5.59組別 戒斷癥狀評分值對照組△

3.2 Morris水迷宮測試結(jié)果

嗎啡戒斷后大鼠的MWM迷宮測試結(jié)果，見表3。表3結(jié)果顯示，與模型組比較，溫針灸組、手針組的平均潛伏期明顯縮短，有非常顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，提示其空間學(xué)習(xí)能力明顯改善;與手針組比較，溫針灸組的平均潛伏期明顯縮短，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，提示溫針灸組在改善戒斷大鼠空間學(xué)習(xí)能力方面優(yōu)于手針組。

表3 嗎啡戒斷后不同組別大鼠MWM迷宮測試(±s)

表3 嗎啡戒斷后不同組別大鼠MWM迷宮測試(±s)

注:與對照組比較，▲P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.01;與溫針灸組比較，●P ＜0.05。

組別 例數(shù)(只)平均潛伏期(s)第3天 第4天 第5天對照組 10 12.50 ±3.38☆ 11.12±2.80☆ 8.87 ±3.48☆模型組 10 50.12 ±6.79▲ 46.00 ±4.53▲ 43.25 ±6.52溫針灸組 10 27.2 ±10.18▲☆ 25.84 ±11.21▲☆ 24.5 ±9.72▲☆手針組 10 32.7 ±11.23▲☆● 29.37 ±10.76▲☆● 7.02 ±9.96▲☆●

3.3 NMDA－NR2B受體表達的變化

不同的方法治療6天后，嗎啡戒斷大鼠NAc腦區(qū)NMDA－NR2B受體在神經(jīng)元細胞質(zhì)中陽性表達(陽性染色細胞的平均光密度)，見表4所示。

表4 各組大鼠腦區(qū)NMDA－NR2B受體表達的影響(±s)

表4 各組大鼠腦區(qū)NMDA－NR2B受體表達的影響(±s)

注:與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與對照組比較，◆P ＜0.05，◆◆P ＜0.01。

NAc對照組 10 0.142 ±0.01組別 n△△模型組 10 0.104 ±0.01◆◆溫針灸組 10 0.135 ±0.01△△◆手針組 10 0.128 ±0.001△△◆

表4結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組、溫針灸組、手針組NAc腦區(qū)的NMDA－NR2B受體表達有顯著性差異(P＜0.01)，表明嗎啡戒斷后大鼠NAc腦區(qū)NMDA－NR2B受體表達降低。與對照組比較，溫針灸組大鼠NAc腦區(qū)的NMDA－NR2B受體表達有顯著性差異(P＜0.05)。與模型組比較，溫針灸組、手針組NAc腦區(qū)的NMDA－NR2B受體表達有非常顯著性差異(P＜0.01)，表明針刺可以增高嗎啡成癮戒斷后大鼠NAc腦區(qū)NMDA－NR2B受體表達，推測與改善戒斷后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)。

4 討論

本實驗以逐日遞增法、快速戒斷法建立嗎啡依賴戒斷SD大鼠模型，實驗結(jié)果顯示，溫針灸可以明顯縮短大鼠Morris水迷宮平均潛伏期(P＜0.01)，調(diào)整大鼠NAc腦區(qū)的NMDA－NR2B受體表達(P＜0.01)，認(rèn)為其可以改善嗎啡戒斷大鼠空間學(xué)習(xí)能力。

Morris水迷宮(Moms Water Maze，MWM)是目前國際通用的空間辨別學(xué)習(xí)記憶模型，用來評定大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。其操作簡單，數(shù)據(jù)可靠，在精神科及神經(jīng)科領(lǐng)域得到了比較廣泛的應(yīng)用。目前，檢測大鼠記憶力的Morris水迷宮的指標(biāo)有很多，包括有定位航行實驗、空間探索實驗等等，其中最常用的評價指標(biāo)是定位航行實驗中的指標(biāo)——“逃避潛伏期”[6]。在定位航行實驗中多次訓(xùn)練大鼠尋找站臺可以提高大鼠的空間學(xué)習(xí)能力[7]。羅小泉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同的入水象限，不同的入水次序?qū)orris水迷宮的檢測大鼠記憶力都有影響。

溫針灸是針刺與艾灸結(jié)合使用的一種方法，具有溫通經(jīng)脈、行氣活血的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，阿片類物質(zhì)成癮后戒斷綜合征主要以肝、脾、腎三臟陰液不足、陰虛火旺為根本病機改變[5]。溫針灸能夠以溫?zé)嵝?yīng)促使機體氣血周身流動，滋陰溫陽，促進機體陰陽平衡，使戒斷癥狀得到抑制，從而起到戒斷毒癮的作用。目前，對于嗎啡成癮后戒斷綜合征多側(cè)重于電針、艾灸單一穴位的實驗研究，很少有關(guān)于溫針灸對于嗎啡成癮戒斷后癥狀作用的研究。

本研究鑒于中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)在藥物依賴形成中所起的重要作用，并基于大腦內(nèi)NAc多巴胺系統(tǒng)為藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)以及藥物戒斷后腦內(nèi)Glu受體表達的改變，從NR2B受體角度分析溫針灸對嗎啡成癮戒斷后空間學(xué)習(xí)能力的影響機制，為針灸治療嗎啡成癮戒斷癥狀的臨床推廣提供新的理論依據(jù)。對于針灸戒毒的研究還應(yīng)加強針灸手法、穴位配伍、針灸時機等不同影響因素的技術(shù)研究，進而評價針灸戒毒的效果，以便更好的指導(dǎo)臨床。

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