孫遠(yuǎn)征，馬 俊，衛(wèi) 哲，王明明

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間接觸阿片類毒品的人來(lái)說(shuō)，發(fā)生戒斷綜合征除了精神癥狀外，往往頻繁出現(xiàn)器質(zhì)性損傷后相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，而且以循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)功能障礙為主，嚴(yán)重者出現(xiàn)心衰、肝衰竭和腎衰竭，直接導(dǎo)致吸毒者生存質(zhì)量的下降，進(jìn)而對(duì)生命構(gòu)成威脅，臨床中致死病例較多。

嗎啡進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)迅速分布于人體大多數(shù)組織中，包括實(shí)質(zhì)性臟器、空腔臟器等。嗎啡進(jìn)入機(jī)體轉(zhuǎn)化的主要部位是肝臟，同時(shí)腎臟等組織對(duì)嗎啡也有代謝作用。嗎啡和其代謝產(chǎn)物主要經(jīng)腎臟隨尿液排泄[1]。另外 Wenedy等[2]用 HPLC 檢測(cè)方法證實(shí)急性染毒大鼠心臟組織嗎啡濃度明顯高于腦組織。相關(guān)尸檢研究[3]證實(shí)因嗎啡成癮致死者心臟、肝臟、腎臟病理組織結(jié)構(gòu)損傷明顯。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察電針對(duì)嗎啡依賴大鼠模型行為學(xué)及其重要臟器組織的Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響，深入研究并探討電針對(duì)嗎啡依賴后心臟、肝臟、腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷的可塑性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD大鼠40只，3～5月齡，體重(280±20)g，雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供。所有大鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、模型組、手針組和電針組，每組10只。

1.2 主要試劑和儀器

鹽酸嗎啡注射液(沈陽(yáng)第一制藥廠)，鹽酸納洛酮注射液(成都倍特藥業(yè)有限公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Bax抗體、Bcl－2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，Envision試劑(DaKo公司)，KWD808Ⅱ脈沖治療儀，LEICARM2145型石蠟切片機(jī)，BH2型OLYMPUS顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 嗎啡成癮模型的建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[4]，隨機(jī)取10只為對(duì)照組，與嗎啡注射組相同時(shí)間、相同方法注射生理鹽水，其余3組逐日遞增法背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液(20 mg/kg，30 mg/kg，40 mg/kg，50 mg/kg，50 mg/kg)，2 次/天(8 am，4 pm)，連續(xù)5 天。于末次注射嗎啡后3 h給予納絡(luò)酮腹腔注射(3 mg/kg)快速戒斷。

1.3.2 觀察大鼠戒斷癥狀

納洛酮注射后1 h內(nèi)，觀察小鼠催促戒斷出現(xiàn)的各種戒斷癥狀，記錄動(dòng)物戒斷癥狀分值，按改進(jìn)的柳田知司評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評(píng)分。分別為異常姿勢(shì)(2分);高度激惹:觸碰(1分)，靠近(2分);意向性震顫:間斷性(1分)，連續(xù)性(2分);咬牙:間斷性(0.5分)，連續(xù)性(1分);煩躁不安:輕度(0.5分)，明顯(1分);流淚(4分);腹瀉:軟便(4分)，不成形(8分);流涎:輕度(1分)，明顯(2分);體重減輕:2%(0分)，2% ～4%(5分)，4% ～6%(10分)，6% ～8%(15分)。然后將記錄的數(shù)據(jù)相加。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

對(duì)照組:按上述方法造模，于第6天開始采用與電針組相同的方法固定，連續(xù)6天。

模型組:按上述方法造模，于第6天開始采用與電針組相同的方法固定，連續(xù)6天。

電針組:按上述方法造模，于第6天開始進(jìn)行電針電針刺激百會(huì)、雙側(cè)心俞、肝俞、腎俞、足三里、三陰交穴，取穴方法依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》相關(guān)內(nèi)容，電針采用疏密波，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度以大鼠下肢輕微抖動(dòng)為度，15 min/次，1 次/天，共6 天。

手針組:按上述方法造模，于第6天開始進(jìn)行針刺治療，取穴及針刺時(shí)間同電針組。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)取材及標(biāo)本制備

各組動(dòng)物模型成功建立后，將動(dòng)物麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開胸壁暴露心臟，立即作左心室插管，先用生理鹽水灌注，剪開右心房，同時(shí)打開腹腔暴露肝臟，至肝臟變白，約灌注20 min，再用4%多聚甲醛/0.1%DEPC灌流固定約40 min，取心臟、肝臟、腎臟組織，分別浸入固定液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm片厚連續(xù)切片，HE染色后光鏡觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.5 檢測(cè)方法

凋亡細(xì)胞的檢測(cè):根據(jù)試劑公司提供的試劑盒，按相關(guān)說(shuō)明書進(jìn)行，即TUNEL法檢測(cè)，并進(jìn)行圖像分析。

組織凋亡相關(guān)基因Bax蛋白、Bcl－2蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè):采用EnvisionⅠ法檢測(cè)，具體操作步驟依據(jù)試劑公司提供的試劑盒，按相關(guān)說(shuō)明書進(jìn)行，并進(jìn)行圖像分析。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

隨機(jī)選取3個(gè)視野，在微測(cè)框(5 mm×5 mm)內(nèi)對(duì)相鄰切片的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞及Bax、Bcl－2陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，采用單因素方差分析(one－way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組嗎啡依賴大鼠催癮后戒斷癥狀比較

在納洛酮注射1 h后，模型組、手針組和電針組大鼠出現(xiàn)異常姿勢(shì)、震顫、咬牙、煩躁、流淚等戒斷癥狀較對(duì)照組明顯，同時(shí)戒斷癥狀評(píng)分結(jié)果顯示模型組、手針組、電針組與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明嗎啡依賴模型建立成功。見表1。

表1 各組大鼠戒斷癥狀評(píng)分(分，m±s)

2.2 各臟器HE染色結(jié)果

2.2.1 心臟 光鏡下，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核形態(tài)呈圓形或橢圓形，染色均勻，見圖1;模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，部分胞膜破裂，細(xì)胞核有固縮和腫脹現(xiàn)象，再者細(xì)胞核碎裂及溶解，出現(xiàn)無(wú)核區(qū)，染色不均勻，見圖2;電針組與手針組心肌細(xì)胞排列較規(guī)整，胞質(zhì)染色較模型組均勻，細(xì)胞核固縮、腫脹、碎裂及溶解現(xiàn)象較模型組明顯減少，見圖3、圖4。

圖1 對(duì)照組心臟組織HE染色×400

圖2 模型組心臟組織HE染色×400

圖3 電針組心臟組織HE染色×400

圖4 手針組心臟組織HE染色×400

圖5 對(duì)照組肝臟組織HE染色×400

圖6 模型組肝臟組織HE染色×400

圖7 電針組肝臟組織HE染色×400

圖8 手針組肝臟組織HE染色×400

圖9 對(duì)照組腎臟組織HE染色×400

圖10 模型組腎臟組織HE染色×400

圖11 電針組腎臟組織HE染色×400

圖12 手針組腎臟組織HE染色×400

2.2.2 肝臟 光鏡下，對(duì)照組肝小葉形態(tài)完整，肝索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀，肝細(xì)胞規(guī)整，胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，染色均勻，見圖5;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核出現(xiàn)空泡樣變性，部分核破裂及溶解，染色不均勻，見圖6;電針組與手針組肝小葉較整齊，細(xì)胞核空泡樣變、破裂及溶解現(xiàn)象較模型組明顯減少，見圖7、圖8。

2.2.3 腎臟 光鏡下，對(duì)照組腎小球及腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，染色均勻，見圖9;模型組腎小管出現(xiàn)萎縮或擴(kuò)張現(xiàn)象，上皮細(xì)胞核有空泡樣變，并有碎裂及溶解，出現(xiàn)無(wú)核區(qū)，染色不均勻，見圖10;電針組與手針組腎小管形態(tài)較規(guī)則，上皮細(xì)胞變性程度較模型組明顯減輕，見圖11、圖12。

2.3 各臟器細(xì)胞凋亡結(jié)果

細(xì)胞凋亡結(jié)果以凋亡指數(shù)(AI)表示，即每100細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)。圖像分析結(jié)果顯示，心臟、肝臟和腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)，模型組與對(duì)照組比較均有非常顯著意義(P＜0.01)，手針組、電針組與模型組比較差異均有非常顯著意義(P＜0.01)，電針組與手針組比較差異有顯著意義(P＜0.05)，提示嗎啡依賴可以促進(jìn)心臟、肝臟及腎臟組織的細(xì)胞凋亡，而電針可以有效的抑制細(xì)胞凋亡。見表2。

表2 各臟器細(xì)胞凋亡的AI值(%，m±s)

2.4 各臟器細(xì)胞Bax、Bcl－2蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

圖像分析結(jié)果顯示，見表3、表4、表5，對(duì)于心臟、肝臟和腎臟組織，手針組、電針組、模型組和對(duì)照組比較Bax、Bcl－2蛋白均有表達(dá)，差異有非常顯著意義(P＜0.01)，其中模型組以Bax值升高為主，Bcl－2/Bax較對(duì)照組明顯減低;手針組和電針組以Bcl－2值升高為主，Bcl－2/Bax較對(duì)照組明顯升高。手針組、電針組與模型組Bax、Bcl－2蛋白表達(dá)比較差異有非常顯著意義(P＜0.01)，以Bcl－2值升高為主，Bcl－2/Bax較模型組明顯升高。電針組與手針組 Bax、Bcl－2蛋白表達(dá)比較差異有顯著意義(P＜0.05)，提示嗎啡依賴后能明顯的促進(jìn)心臟、肝臟和腎臟組織的Bax蛋白的表達(dá)，而針刺能抑制其Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)其Bcl－2蛋白的表達(dá)，其中電針的效果明顯。

表3 心臟組織Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2，m ±s)

表4 肝臟組織Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2，m ±s)

表5 腎臟組織Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2，m ±s)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)及其他相關(guān)研究表明，嗎啡經(jīng)體內(nèi)代謝過(guò)程對(duì)臟器有不同程度的損傷，以心臟、肝臟、腎臟為主，其組織結(jié)構(gòu)破壞繼而造成其功能障礙進(jìn)而并發(fā)軀體疾病是戒毒過(guò)程中致死的不可忽視的原因，羅氏等[6]在阿片類物質(zhì)依賴者常見并發(fā)軀體疾病調(diào)查報(bào)告顯示參與調(diào)查的2 583例中有1 768例患有軀體并發(fā)疾病，占調(diào)查人數(shù)的68.45%，共涉及8類33種疾病?；加熊|體并發(fā)疾病的阿片類濫用者的平均年齡與整體樣本無(wú)差別，但患有軀體并發(fā)疾病者的平均濫用量大，濫用時(shí)間長(zhǎng)，提示濫用量大和濫用時(shí)間長(zhǎng)可能是并發(fā)軀體疾病多的原因之一。其中以循環(huán)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、泌尿生殖系統(tǒng)疾病并發(fā)為主?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為臟器細(xì)胞凋亡是促進(jìn)軀體重要臟器損傷的主要因素，細(xì)胞凋亡是由基因介導(dǎo)的一種細(xì)胞“主動(dòng)自殺”的死亡方式。業(yè)已證明[7～9]，Bcl－2 和 Bax參與細(xì)胞凋亡的精密調(diào)控，Bcl－2基因是目前發(fā)現(xiàn)的抗凋亡作用最強(qiáng)的基因之一，Bcl－2抗凋亡是通過(guò)抗氧化，抑制促凋亡蛋白釋放和促凋亡調(diào)節(jié)子Bax的細(xì)胞毒性等機(jī)制完成的。Bax為Bcl－2的相關(guān)蛋白，可與Bcl－2呈共價(jià)結(jié)合，它在結(jié)構(gòu)上與Bcl－2有廣泛的氨基酸同源性，集中在高度保守區(qū)Ⅰ和Ⅱ內(nèi)。Bax由6個(gè)外顯子編碼。在體內(nèi)Bax形成同源二聚體或與 Bcl－2形成異源二聚體，Bax－Bax二聚體形成并增加時(shí)，便促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，再者Bax的過(guò)度表達(dá)可加速IL－3依賴細(xì)胞株撤除IL－3所致的凋亡，也對(duì)抗Bcl－2抑制凋亡的活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠重要臟器的細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表達(dá)，證實(shí)嗎啡依賴能明顯促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，使其Bax蛋白表達(dá)明顯增高，通過(guò)針刺方法，尤其是電針能有效的抑制大鼠心、肝、腎重要臟器的細(xì)胞凋亡，使Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl－2蛋白表達(dá)明顯增高，從而對(duì)其損傷后的組織結(jié)構(gòu)起到修復(fù)作用，減輕因損傷引發(fā)的功能障礙，降低嗎啡戒斷過(guò)程中軀體并發(fā)癥的發(fā)生及致死率。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為毒品如嗎啡產(chǎn)生依賴性是因毒液及煙毒蘊(yùn)結(jié)于內(nèi)，使氣血津液受損，終致臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，主要涉及的臟腑為心肝腎三臟，清代醫(yī)家對(duì)鴉片成癮有肺癮、心癮、脾癮、肝癮、腎癮等五臟癮證[10]之說(shuō)，謝氏[11]在對(duì)戒斷綜合征的中醫(yī)辨證分型中包括心癮氣虛證、心癮陽(yáng)虛證、心癮陰陽(yáng)兩虛證、心癮陽(yáng)氣暴脫證;肝癮血虛證;腎癮陽(yáng)虛證、腎癮陰陽(yáng)兩虛證。綜合以上病因病機(jī)，治療中選取百會(huì)(醒腦開竅、安神定志)、雙側(cè)心俞(補(bǔ)益心氣、養(yǎng)心安神)、肝俞(疏肝養(yǎng)血、平肝潛陽(yáng))、腎俞(溫補(bǔ)腎陽(yáng)、滋補(bǔ)腎陰)、足三里(調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣)、三陰交(健脾益血、調(diào)肝補(bǔ)腎)，加以電針刺激使氣血周動(dòng)，濡養(yǎng)周身，致五臟六腑陰陽(yáng)調(diào)和，功能恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明電針刺激以上諸穴位能明顯的抑制嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀，減輕其軀體并發(fā)癥。綜上所述，筆者認(rèn)為嗎啡依賴后會(huì)導(dǎo)致全身臟器尤其是心臟、肝臟、腎臟重要臟器的組織結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)與其組織細(xì)胞凋亡關(guān)系確切，因而在戒斷綜合征的治療過(guò)程中應(yīng)對(duì)戒毒者相關(guān)的軀體并發(fā)疾病予以重視并進(jìn)行相應(yīng)的對(duì)癥治療。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明電針刺激百會(huì)、雙側(cè)心俞、肝俞、腎俞、足三里、三陰交穴能有效的抑制嗎啡依賴大鼠重要臟器組織的細(xì)胞凋亡，對(duì)損傷后臟器的組織結(jié)構(gòu)具有明顯可塑作用，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡來(lái)治療戒斷過(guò)程中產(chǎn)生的軀體并發(fā)疾病是其可能機(jī)制。

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