杜培明，汪寧寧，史曉麗

（安徽工業(yè)大學(xué) 電氣信息學(xué)院，安徽 馬鞍山243000）

細(xì)胞計(jì)數(shù)是生物醫(yī)學(xué)檢查的一項(xiàng)重要內(nèi)容，生物體中的細(xì)胞有其生理功能，在不同生理狀態(tài)下，可引起細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的變化。這種變化是判斷有無疾病以及疾病種類和嚴(yán)重程度的重要依據(jù)。而在實(shí)際細(xì)胞圖像中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞聚在一起的現(xiàn)象，稱為細(xì)胞粘連。在計(jì)數(shù)的過程中，需要把這些粘連的區(qū)域分割成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞。近年來，針對分割粘連細(xì)胞的問題，研究人員提出了很多分割方法[1-2]。其中，分水嶺圖像分割方法[3]是一種基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的經(jīng)典算法，它以快速、準(zhǔn)確、有效等特點(diǎn)越來越受到人們的重視，目前已廣泛應(yīng)用于圖像分割領(lǐng)域。分水嶺圖像分割方法采用的原理主要有模擬浸水過程[4]和模擬降水過程[5]兩種。使用分水嶺算法對圖像進(jìn)行分割，可以產(chǎn)生單像素寬的連續(xù)邊界，但是通常由于噪聲等因素的影響，使得直接使用分水嶺算法對圖像進(jìn)行分割會(huì)產(chǎn)生過分割現(xiàn)象。為了避免或抑制過分割現(xiàn)象，國內(nèi)外的學(xué)者提出了很多方法，總結(jié)起來有兩種：一種是在應(yīng)用分水嶺算法之前進(jìn)行預(yù)處理，抑制噪聲等的影響[6]；另一種是在分水嶺分割后，根據(jù)某種準(zhǔn)則進(jìn)行區(qū)域合并。

斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像的一個(gè)特點(diǎn)就是細(xì)胞粘連非常嚴(yán)重，這給斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像的分割帶來了很大的困難。本文在對斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像進(jìn)行分割時(shí)，針對粘連比較嚴(yán)重的情況，先對圖像進(jìn)行預(yù)處理，然后使用分水嶺方法進(jìn)行分割。

1 斑馬魚簡介

斑馬魚是一種體長3～4 cm的熱帶魚，因其色彩鮮明的斑紋得名。這種小魚雖然十分常見，卻一直是科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)，因?yàn)樗哂凶晕倚迯?fù)破損視網(wǎng)膜的獨(dú)特能力。對斑馬魚視網(wǎng)膜能夠自我修復(fù)的能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其視網(wǎng)膜內(nèi)的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞能夠分化成健康的視網(wǎng)膜細(xì)胞，從而修復(fù)受損的視網(wǎng)膜?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，人類的視網(wǎng)膜中也擁有類似于斑馬魚能夠修復(fù)視網(wǎng)膜的細(xì)胞。研究人員在老鼠身上進(jìn)行的移植實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功。向患有視網(wǎng)膜疾病的老鼠體內(nèi)移植放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞分化為健康視網(wǎng)膜細(xì)胞，使視網(wǎng)膜功能恢復(fù)。如果這項(xiàng)技術(shù)能夠應(yīng)用于人類，將會(huì)使數(shù)以萬計(jì)患有眼部疾病的患者重見光明。

彩色斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像如圖1(a)和圖2(a)所示，其灰度化圖像分別如圖1(b)和圖2(b)所示。

由圖1和圖2所示的斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像可以看出，圖中有多處粘連的細(xì)胞區(qū)域，特別是圖2中左下部分區(qū)域，有多處多個(gè)細(xì)胞粘連的現(xiàn)象。

2 距離變換

距離變換在分割一群相互粘連的近圓形物體的情況下比較有用。針對斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像中大塊的粘連細(xì)胞，首先采用距離變換的方法，提取粘連細(xì)胞區(qū)域中各細(xì)胞近似中心點(diǎn)處的信息。

距離變換是將一幅表示目標(biāo)的二值圖像轉(zhuǎn)化為一幅灰度圖像，這幅灰度圖像中某點(diǎn)的灰度值就是表示原始二值圖像中相應(yīng)坐標(biāo)點(diǎn)關(guān)于最近目標(biāo)的距離。常用的距離度量方法有歐氏距離、城市街區(qū)距離和棋盤距離。本文使用近似的歐氏距離,在保證運(yùn)算結(jié)果不影響分割效果的前提下,無需浪費(fèi)大量的時(shí)間和存儲(chǔ)空間來計(jì)算精確的歐氏距離,因此采用Chamfer 3/4距離變換。

在進(jìn)行距離變換之前，先對其灰度化圖像進(jìn)行二值化。要得到某一像素點(diǎn)的全局距離值，需要對圖像進(jìn)行前后兩次掃描。前向掃描時(shí)，按從上到下、從左到右的順序，取上鄰域的最小值改變當(dāng)前距離值；再反向掃描，按從下到上、從右到左的順序，利用鄰域值進(jìn)行修正，修正后模板中心點(diǎn)的距離值即為該點(diǎn)的全局距離值。在對圖像進(jìn)行Chamfer 3/4距離變換后，灰度值為0的像素點(diǎn)變換前后距離值不變，而非0像素點(diǎn)距0值像素點(diǎn)的距離越遠(yuǎn)灰度值越大。

對距離變換后的圖像進(jìn)行取反運(yùn)算，使背景距離值為最大。這樣在細(xì)胞的近似中心點(diǎn)處出現(xiàn)了局部灰度極小值，且局部灰度極小值點(diǎn)到細(xì)胞邊界各處的距離近似相等，類似于圓的圓心。這些局部灰度極小值點(diǎn)對分割有很重要的作用,需要對其進(jìn)行提取。

3 種子點(diǎn)獲取及合并

在經(jīng)過距離變換后的灰度圖像中，目標(biāo)區(qū)域已經(jīng)出現(xiàn)了局部極小值點(diǎn)，對這些極小值點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，這些標(biāo)記的局部極小值點(diǎn)稱為種子點(diǎn)。在斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像中，由于幾個(gè)細(xì)胞互相粘連，會(huì)導(dǎo)致在一個(gè)細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部出現(xiàn)多個(gè)種子點(diǎn)，而每個(gè)種子點(diǎn)在分割時(shí)都代表一個(gè)細(xì)胞，這樣一個(gè)細(xì)胞就會(huì)被分割成多個(gè)區(qū)域，從而導(dǎo)致過分割。為了正確地分割這些粘連的細(xì)胞，需要合并種子點(diǎn)，刪除錯(cuò)誤的不應(yīng)出現(xiàn)的種子點(diǎn)。

本文根據(jù)種子點(diǎn)之間的距離值進(jìn)行合并。計(jì)算兩個(gè)種子點(diǎn)之間的距離，并統(tǒng)計(jì)最大和最小距離值，求出平均距離。根據(jù)平均距離，設(shè)閾值對種子點(diǎn)進(jìn)行合并，刪除距離過小的種子。根據(jù)計(jì)算的距離值獲取種子點(diǎn)的具體方法如下。

(1)遍歷距離圖像,獲取5×5鄰域的極小值,并設(shè)bMin=true；

(2)獲取極小值點(diǎn)的上鄰域標(biāo)記label。判斷掃描過的點(diǎn)是否有標(biāo)記，如果標(biāo)記過（label!=0），賦為相同標(biāo)記值；否則標(biāo)記值+1，再賦為標(biāo)記；

(3)將其5×5鄰域像素點(diǎn)都賦予該種子標(biāo)記值作為種子區(qū)域，并統(tǒng)計(jì)種子中心點(diǎn)的位置；

(4)刪除兩個(gè)距離過小的種子。設(shè)定閾值 threshold，計(jì)算任意兩個(gè)種子中心點(diǎn)之間的距離dis。若dis≤threshold，則將前一個(gè)種子標(biāo)記刪除，后續(xù)各標(biāo)記值都相應(yīng)減1。

圖1和圖2所示的兩幅斑馬魚視網(wǎng)膜圖像的種子圖像如圖3所示。種子點(diǎn)是按從小到大的順序進(jìn)行標(biāo)記的，值為 1，2，3，...。

4 分水嶺變換

基于模擬浸水的分水嶺變換過程中，水從盆地中慢慢上漲，當(dāng)處在不同盆地中的水快要相交時(shí)，在相交處修建水壩（分水線）進(jìn)行阻隔，最后得到一個(gè)個(gè)水壩和被淹沒的各個(gè)盆地，從而達(dá)到分割的目的。在對斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像經(jīng)過以上預(yù)處理的基礎(chǔ)上，對得到的種子圖像使用分水嶺方法進(jìn)行分割,具體算法如下：

(1)統(tǒng)計(jì)直方圖,獲取初始水位minVal,水位上升Val++；

(2)掃描圖像，獲取圖像中未被標(biāo)記且小于水位的像素點(diǎn)；

(3)判斷種子附近點(diǎn)像素，若附近有單一的種子點(diǎn)，則置為標(biāo)記；若有多個(gè)種子點(diǎn)（有標(biāo)記但和當(dāng)前標(biāo)記值不同），則置為分水嶺，bEdge=true，并設(shè) bover==false；

(4)若 bover==false，轉(zhuǎn)到步驟(2)重復(fù)生長，直至水位不再上升為止bover==true。

以上所論述方法已通過Visual Studio 2008編程實(shí)現(xiàn)。對圖3所示的兩幅斑馬魚種子圖像使用分水嶺變換，得到的分割結(jié)果如圖4所示，分割出的每個(gè)區(qū)域都用不同的顏色表示以示區(qū)分。從兩幅結(jié)果圖可以看出，在有多個(gè)細(xì)胞粘連的區(qū)域處用深色分水線分割開了，分水線兩側(cè)的區(qū)域分屬于兩個(gè)不同的細(xì)胞。

表1為對兩幅斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像的分割結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。根據(jù)數(shù)據(jù)可以看出，兩幅圖像的分割區(qū)域個(gè)數(shù)與人工觀察得到的個(gè)數(shù)誤差分別為-3.79%和-5.24%，只有很少一部分粘連在一起的細(xì)胞未被分開，還有極小的部分存在過分割現(xiàn)象。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，存在誤差的原因有：由于圖像中有些細(xì)胞邊界比較模糊，圖像中有非細(xì)胞物質(zhì)的存在，容易判讀成細(xì)胞；有極少數(shù)細(xì)胞粘連特別嚴(yán)重，沒有被分開。誤差在允許的范圍之內(nèi)，可以被忽略。

表1 分割結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

通過對斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像的分割研究發(fā)現(xiàn)，在處理輪廓模糊、邊界不清的粘連細(xì)胞圖像時(shí)，使用距離變換的方法可獲取區(qū)域局部極小值，分離出粘連在一起的區(qū)域；再合并相近的種子點(diǎn)，可以減少過分割現(xiàn)象；最后使用分水嶺分割算法，較好地解決了粘連細(xì)胞區(qū)域的分割問題。實(shí)驗(yàn)證明，本文提出的方法能有效地分割斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像，但仍存在一定的欠分割現(xiàn)象。

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