仙臺病毒RT-PCR檢測方法的建立及灰倉鼠中流行情況調(diào)查

李曉波，付 瑞，王 吉，衛(wèi) 禮，邢 進(jìn)，馮育芳，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

仙臺病毒屬于副粘病毒科，副粘病毒屬，核酸型為單股負(fù)鏈 RNA，基因組全長 15 384 bp［1］，編碼6 個結(jié)構(gòu)蛋白(L，P，NP，HN，F(xiàn)，M)和一個非結(jié)構(gòu)蛋白C，其基因排序次序為:3'-Leader-NP-P+C-M-FHN-L-Leader-5'［2］。仙臺病毒傳染性強(qiáng)，容易擴(kuò)散，是嚙齒類實驗動物最難控制的病毒之一。嚙齒類實驗動物感染SeV會對其免疫系統(tǒng)、致瘤作用及繁殖等產(chǎn)生影響，從而影響實驗結(jié)果［3］，動物一旦感染很難清除，嚴(yán)重影響幼鼠生長發(fā)育并降低成年鼠的繁殖率［4］。

現(xiàn)有的實驗動物種屬和品系已越來越不能滿足科學(xué)快速發(fā)展的要求，迫切需要開發(fā)更多適應(yīng)不同要求的新型實驗動物，灰倉鼠(Cricetulus migratorius)就是在包蟲病研究中篩選出來的一種鼠類?；覀}鼠屬于嚙齒目，倉鼠科，倉鼠亞科，倉鼠屬。廣泛分布于中亞地區(qū)，棲息生境從荒漠平原至海拔3 000 m以上的高山草甸均有分布。已查明該鼠在自然界參與土拉倫、森林腦炎、鼠疫等多種自然疫源性疾病傳播［5，6］，并且對仙臺病毒易感。目前我國還沒有關(guān)于灰倉鼠仙臺病毒感染的報道，也沒有可用于灰倉鼠SV的檢測方法。我們針對仙臺病毒L基因設(shè)計引物，建立了仙臺病毒 RT-PCR檢測方法，并對60只采自我國新疆地區(qū)的灰倉鼠，進(jìn)行SV感染的檢測。

1 材料

1.1 試劑

AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物購自 Promega公司;RNA酶抑制劑購自莊盟公司;Taq Hs DNA酶、dNTP、100 bp DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司，RNA提取試劑盒購自Qiagen公司。

1.2 病毒毒株及疫苗

仙臺病毒、猴副流感病毒(SV5)、犬瘟熱病毒、小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒III型均為本實驗室保存。腮腺炎病毒減毒活疫苗來自本院病毒一室。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 灰倉鼠

由新疆地方病防治研究所提供。普通級環(huán)境飼養(yǎng)，60只，成年，體重在(40～50)g之間，雌雄各半。

2 方法

2.1 病毒的培養(yǎng)

用8～13日齡的雞胚，SeV毒種接種絨毛尿囊腔，接種后第4天收獲尿囊液，凍－70℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 RNA的提取

取0.5 mL上述上清液按試劑盒的操作說明提取RNA，最后用40 μL去RNA酶的無菌水溶解。

2.3 RT-PCR方法建立

2.3.1 逆轉(zhuǎn)錄:25 μL反應(yīng)體系中含5×RT buffer 5 μL，d NTP(2.5 mmol/L)4 μL，隨機(jī)引物(500 μg/mL)1 μL，AMV(10 U/μL)0.5 μL，RNA 酶抑制劑(40 U/μL)0.5 μL，病毒 RNA 8 μL，反應(yīng)條件:37℃90 min，72℃ 15 min，4℃ 5 min。

2.3.2 PCR引物設(shè)計:參照NCBI發(fā)表的仙臺病毒(gi:9627219)基因組序列設(shè)計引物，引物信息見表1，由生工生物工程(上海)有限公司合成，使用時用滅菌超純水稀釋為10 μM，PCR產(chǎn)物長度為197 bp。

表1 SeV RT-PCR引物Tab．1 Primers for the SeV RT-PCR

2.3.3 PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系包括，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，引物(10 μmol/L)各 1μL，cDNA 2 μL，Taq Hs酶(5 U/μL)0.5 μL，滅菌 dH2O 16 μL。反應(yīng)條件:94℃ 變性 45 s，56℃ 退火45 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

2.4 RT-PCR方法的驗證

2.4.1 敏感性:紫外分光法測定SV cDNA濃度，將cDNA10倍系列稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定方法的最大檢出限。

2.4.2 特異性:分別提取小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒III型、猴副流感病毒、腮腺炎病毒、犬瘟熱病毒、正常雞胚尿囊液及小鼠肺臟組織 RNA，用建立的RT-PCR法進(jìn)行檢測，測定方法的特異性。

2.5 灰倉鼠的檢測

每一份樣本按以下方法處理:取灰倉鼠肺臟約100 mg，加入900 μL 滅菌 PBS，勻漿后12 000 r/min 離心10 min，上清液用0.2 μm 濾膜過濾，取400 μL 過濾后的上清，用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取RNA。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR結(jié)果及測序

3.1.1 RT-PCR結(jié)果:SeV毒株提取RNA后經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖電泳，可見在197 bp處有預(yù)期的目標(biāo)條帶(圖1)。

3.1.2 RT-PCR產(chǎn)物測序:PCR產(chǎn)物直接送上海生工公司測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，與SeV(dbj∣ AB275416.1∣)相應(yīng)序列符合率達(dá)98%(圖 2)。

3.2 靈敏性測定

紫外分光光度法測得SeV cDNA的濃度為968.6 μg/mL，將 cDNA 進(jìn)行 10－1～10－6稀釋，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖3可見，在10－4稀釋的時候仍可見目的條帶，說明本研究建立的PCR技術(shù)方法能檢測的SV cDNA最低濃度是96.8 ng/mL。

圖1 SeV毒種RT-PCR擴(kuò)增Fig．1 RT-PCR amplification for SeV．

圖2 SeV毒種RT-PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果Fig．2 The BLAST results of sequencing of SeV RT-PCR products．

3.3 特異性測定

分別以小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒III型、猴副流感病毒、腮腺炎病毒、犬瘟熱病毒及正常的雞胚尿囊液和小鼠肺臟組織為對照，用建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明:僅有SV毒株有197 bp的目的條帶，而其他對照均沒有任何條帶(圖4)，說明本方法有較好的特異性。

3.4 灰倉鼠中SV的檢測

3.4.1 取灰倉鼠肺組織，提取總 RNA，采用 RTPCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測到2份樣本陽性(圖5只顯示部分結(jié)果)，陽性率為3.33%(2/60)。

3.4.2 SeV陽性樣本測序:陽性樣本的 PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序結(jié)果與NCBI發(fā)表的SeV(gb∣DQ219803.1∣)基因組相應(yīng)序列的符合率為98%，證實為仙臺病毒感染(圖6)。

圖3 敏感性試驗結(jié)果1:DNA marker 2～7:SeV cDNA 分別 10－1～10－6稀釋 8:陰性對照Fig．3 The results of sensitivity test of the RT-PCR products．Lane 1:DNA marker;2～7:10－1～10－6 dilution of SeV cDNA;8:Negative control

圖4 特異性試驗結(jié)果Fig．4 Results of specificity test of the detection technique for Sendai virus．

圖5 60份灰倉鼠樣本部分檢測結(jié)果1:仙臺陽性對照 2～11:樣本12:陰性對照 M:DNA markerFig．5 Some results of RT-PCR assay for sixty Cricetulus migratorius samples．Lane 1:SeV positive control;2～11:Samples;12:Negative control;M:DNA marker

4 討論

圖6 灰倉鼠SeV陽性樣本測序比對結(jié)果Fig．6 The BLAST results of RT-PCR products sequencing of SeV-positive samples of Cricetulus migratorius．

本實驗的灰倉鼠來自新疆地方病防治研究所，廖立夫教授等早在上世紀(jì)90年代就開始從事野生灰倉鼠的馴化繁殖工作，現(xiàn)在已經(jīng)成功繁育出具有一定規(guī)模的動物種群［7］，雖然目前已有灰倉鼠用于各種實驗研究的報道，但作為一種實驗動物，其標(biāo)準(zhǔn)化程度還較低。

實驗嚙齒類動物是SV的自然宿主，自然條件下SV能感染小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠?；覀}鼠作為新的實驗動物品種，迫切需要對其微生物攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，灰倉鼠與實驗常用的地鼠同屬倉鼠科，倉鼠屬，實驗動物國標(biāo)將SV列為SPF地鼠的必檢項目［8］，因此，我們對灰倉鼠中攜帶 SeV的情況進(jìn)行了調(diào)查。

血清學(xué)調(diào)查顯示仙臺病毒在小鼠等嚙齒類實驗動物中感染率較高，但國內(nèi)外還沒有灰倉鼠中SV感染率調(diào)查的相關(guān)報道。病毒的分離鑒定是仙臺病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，除雞胚外，SV也可在BHK21或Vero細(xì)胞上進(jìn)行增殖［3］，但病毒分離鑒定周期較長，費(fèi)時費(fèi)力;目前，國內(nèi)主要采用ELISA方法檢測動物血清中的SV抗體，ELISA雖然具有較高的敏感性，但需要純度很高的純化檢測抗原，并不適用于檢測乳鼠和免疫缺陷動物，同時對抗體的檢測不能反應(yīng)當(dāng)前病毒的感染情況。PCR技術(shù)作為分子生物學(xué)檢測的重要方法，具有快速、敏感、簡便等優(yōu)點，國內(nèi)外已有 SV RT-PCR檢測方法的相關(guān)報道［9－11］。與之相比，我們建立的 SV RT-PCR 檢測方法具有更好的特異性和敏感性(結(jié)果未顯示)，適用于對動物當(dāng)前的病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查。

雖然本次檢出的灰倉鼠SV感染率較低，陽性動物也無明顯臨床癥狀，但是該病毒可通過直接接觸和空氣傳播的方式擴(kuò)散，給整個種群SV感染的控制帶來很大困難，需要引起我們的重視。本實驗建立的SV RT-PCR檢測方法，也為今后制定灰倉鼠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝:感謝新疆地方病防治研究所廖立夫教授等對本課題的大力支持!

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