蘇松坤 汪理想, 潘 嬌 劉 芳 陳大福 戴雙進 陳盛祿

（1 浙江大學動物科學學院，杭州 310058；2 福建農(nóng)林大學蜂學學院，福州 350002）

隨著社會的進步，蜜蜂對人類的價值越來越被重視，其授粉作用的不可替代性及相應蜂產(chǎn)品的營養(yǎng)價值也使得人們越來越關注養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展，病蟲害一直是威脅養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的最大問題。利用抗生素等化學藥品在一定程度上控制住疾病，但長期使用卻削弱了蜜蜂的抵抗力，增強病原的耐藥性，迫使人們不得不加大使用劑量，如此形成惡性循環(huán)，危害了環(huán)境也造成蜂產(chǎn)品藥物殘留。隨著人們對食品質量要求的不斷提高及環(huán)保意識的不斷增強，不使用殺蟲劑和抗生素的自然態(tài)抵御蜜蜂病蟲害的方法越來越受到人們重視。

蜜蜂的衛(wèi)生行為指其能夠檢查、咬開封蓋房并清除已染病害的蜜蜂蟲蛹。已有的衛(wèi)生行為測試即是通過檢測蜂群對冷凍致死封蓋子的清除能力，來評估蜂群對染病封蓋子的清除能力[1]。早年美國就開始培育抗病和抗螨的蜜蜂品系，他們發(fā)現(xiàn)，清巢能力強的蜜蜂品系很少患美洲幼蟲腐臭病或白堊病，蜂螨也少。這類蜜蜂品系能發(fā)現(xiàn)并迅速移走患病或被蜂螨感染的幼蟲，移除病原體從而限制疾病的傳播。衛(wèi)生行為是一種隱性性狀，只有蜂王和雄蜂均來自具有衛(wèi)生行為的蜂群時，后代工蜂才能表現(xiàn)出衛(wèi)生行為。1990年白堊病在江浙一帶發(fā)生后迅速蔓延到全國各地，嚴重危害了我國養(yǎng)蜂業(yè)，廣大蜂農(nóng)也因此迫切希望能夠選育出既高產(chǎn)又能抗白堊病的蜂種。有研究表明，不同品種、品系的蜜蜂，甚至同一品種、品系內(nèi)的不同蜂群，其抗白堊病能力、工蜂發(fā)現(xiàn)病蟲時間的早、晚及清除病蟲的能力等特征都存在著遺傳特性上的差異，而這些特征又都和蜂群的抗白堊病能力密切相關。

蜜蜂具有衛(wèi)生行為包括兩個過程，即打開封蓋和移走病蟲、死蟲或者受傷幼蟲。有研究比較了具有衛(wèi)生行為的蜂群和不具有衛(wèi)生行為的蜂群對針扎致死封蓋子在一個小時內(nèi)的死蟲被清除量，結果顯示具有衛(wèi)生行為的蜂群和不具有衛(wèi)生行為的蜂群在清除死蟲的數(shù)量上存在極顯著差異（P＜0.01)[2]。

Rothenbuhler提出蜜蜂的衛(wèi)生行為是由基因控制的，u代表打開封蓋子，r代表清除不正常幼蟲，當親本基因為uu/rr時，蜜蜂就同時具有打開封蓋房和清除不正常幼蟲的行為[3]。具有衛(wèi)生行為的蜜蜂消除了病菌的感染和減弱了疾病在蜂群的傳播，同時能夠自我治愈。那些能夠在很短時間內(nèi)移除死亡封蓋子的蜂群就被認為具有衛(wèi)生行為，那些表現(xiàn)出患病特征和在巢脾上有死亡的幼蟲則被認為不具有衛(wèi)生行為。具有衛(wèi)生行為的蜂群移除死亡幼蟲的效率明顯高于不具有衛(wèi)生行為的蜂群，只要經(jīng)過適當?shù)倪x擇就有可能獲得具有很高衛(wèi)生行為的蜂群[4,5]。有研究者已論證多種信號會誘發(fā)蜜蜂對死亡幼蟲的清理，如嗅覺探測、健康幼蟲和被感染或死亡幼蟲的表面溫度[6,7]。通過患美洲幼蟲腐臭病的蜂群或對蜂群注射幼蟲芽孢桿菌來使蜂群患幼蟲腐爛病來研究蜜蜂的衛(wèi)生行為[8]。此外，有研究證實氰化物殺死封蓋子幼蟲或者針扎致死出現(xiàn)血淋巴，增加蜜蜂清除死亡幼蟲的速率，引起了蜜蜂的清理行為[9]。

冰凍致死的封蓋子經(jīng)常被用來調查蜂群的衛(wèi)生行為。用液氮使巢脾迅速處于冰凍狀態(tài)，極短時間內(nèi)殺死封蓋子。殺死封蓋子的方法不同，蜜蜂對其清除的速率就不同。判斷蜂群的衛(wèi)生行為應該將殺死的封蓋子在放入實驗蜂群后不同的時間段測驗。殺死的封蓋子日齡不同，實驗結果也會有所區(qū)別。冰凍致死的封蓋子及時放回蜂群和過幾天后再放回蜂群，蜜蜂會有不同的清除速率，前者會更快。

研究表明，具有衛(wèi)生行為的蜂群可以抵御多種蜜蜂病蟲害的危害。白堊病是蜂群的常患病害之一，在同一蜂場中可能同時存在患病群與健康群，健康蜂群對白堊病有較強的抵抗能力。同時，由于白堊病對蜂群的影響很大，因此疾病抵抗能力蜂種的選育就顯得極為重要。本研究在不同的處理條件下，觀察不同蜂群的清理行為，研究清理能力與抵抗白堊病之間的關系，為判斷蜂群的清理能力及抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

特制的巢礎切塊機、冰柜、智能恒溫恒濕箱、液氮、大頭針、蒸餾水。

1.2 實驗蜂群

所選蜂場為浙江大學華家池實驗蜂場，五群健康的蜂群及六群群勢基本一致的蜂群（每箱四脾，其中兩個為封蓋子脾），其中三群為患白堊病的蜂群，三群為健康的蜂群。

1.3 實驗一：封蓋子脾在不同處理下的死亡情況

將A、B、C、D、E五個蜂群，每群用特制的巢脾切塊機切出八塊大小完全一致的6.5*3.5cm的封蓋子塊，分別在經(jīng)水泡2 h、水泡5 h、水泡24 h、-20℃冰凍2 h、-20℃冰凍4 h、針扎、液氮、空白環(huán)境處理后，放在一個有透氣的小紙箱里面，然后把所有的小封蓋子脾放在34.5℃、70%濕度的智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱里面，每隔一天（24 h）觀察記錄一次封蓋子的出房情況，連續(xù)觀察12 天。

表1 不同條件處理下封蓋子脾的出房率

1.4 實驗二：白堊病患群與健康蜂群清理能力檢測

三群患白堊病蜂群和三群健康蜂群，在保證群勢基本一致的情況下每群用特制的巢脾切塊機切出四塊6.5×3.5 cm的小封蓋子脾，分別在經(jīng)水泡24 h、-20℃冰凍24 h、液氮、針扎處理后，放回原群，每隔24 h觀察記錄一次封蓋子的剩余數(shù)目。連續(xù)觀察三次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

t檢驗用來統(tǒng)計分析不同處理方法的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 實驗一結果

試驗一的結果表明，分別經(jīng)水泡24 h、-20℃冰凍2 h、-20℃冰凍4 h、液氮冷凍和針扎處理后，所有封蓋子均未能成功出房，而水泡2 h、水泡5 h和空白處理組均有蜜蜂出房，詳見表1。

從表1可以看出，空白對照組的封蓋子出房率最高，但也僅僅剛過半數(shù)；水泡2h和水泡5h處理后的封蓋子出房率之間不存在顯著差異（P=0.86＞0.05）但是其出房率均顯著低于空白對照組，當水泡時間延長到24h時，封蓋子全部死亡（即出房率為零）；此外，三種-20℃冰凍條件（2 h, 4 h, 24 h）、液氮冷凍及針扎處理后的封蓋子出房率均為零。由此得知，水泡24h及以上、冰凍、液氮冷凍、針扎等處理方法均可用于后續(xù)的蜂群清理能力檢測試驗。

2.2 實驗二結果

試驗二研究的是實驗組與對照組在24h、48h、72h內(nèi)蜜蜂對實驗封蓋子的清理百分比。其中，分析實驗處理后共三次觀察統(tǒng)計得到的封蓋子剩余量發(fā)現(xiàn)：實驗處理后24h內(nèi)，實驗與對照蜂群對經(jīng)水泡處理的封蓋子清理能力才存在顯著差異，對冰凍處理后后的封蓋子清理能力呈差異極顯著，而對液氮和針扎處理的封蓋子并無顯著差異（見圖1）；處理后48h及72h內(nèi)，蜂群只對經(jīng)水泡24h處理的封蓋子清理能力存在顯著差異，對其他三種處理后的封蓋子清除效果無顯著差異（見圖2，3）。

圖1 24h內(nèi)不同方法對幼蟲的清除率

圖2 48h內(nèi)蜜蜂對幼蟲的清除率

圖3 72h內(nèi)蜜蜂對幼蟲的清除率

由以上三個圖可以得知，采用水泡24h或冰凍24h處理封蓋子脾并在24h或48小時內(nèi)統(tǒng)計蜜蜂對幼蟲的清除率的方法可以篩選具有衛(wèi)生行為的蜂群，并用于培育具有抗白堊病性狀的新蜂種。

3 討論

試驗一保證了使用二中所有的處理結果都是一樣，那就是封蓋子幼蟲的死亡。試驗二的結果顯示，蜜蜂對經(jīng)過針扎致死的幼蟲清理速率明顯高于其它組，實驗組與對照組結果差異不顯著，利用針扎處理不能很好的判斷蜂群的衛(wèi)生行為。

根據(jù) Büchler 的研究結果，蜜蜂在17.3 h內(nèi)移除50%的針扎致死的封蓋子。而我們的試驗顯示，蜜蜂在24h內(nèi)移除了94%的針扎致死的封蓋子幼蟲，說明不同蜂群的衛(wèi)生行為存在差異。試驗結果還顯示，蜜蜂對針扎致死幼蟲的清理速率明顯高于液氮組、水泡組和冰凍組。

本試驗表明，水泡組在48 h內(nèi)都存在差異，冰凍組在24小時內(nèi)存在顯著差異，說明利用水泡24和冰凍的方法能夠很好的凸顯蜂群的清理行為，其他學者也認為冰凍實驗能夠很好的鑒定蜂群的衛(wèi)生行為[10]。Spivak and Gilliam[11]和 Spivak and Reuter[1]曾用液氮處理實驗封蓋子脾，能夠直接把封蓋子殺死，液氮組在三個時間段內(nèi)都沒有顯著性的差異，相關的問題還需要進一步的驗證，蜂群對經(jīng)過液氮處理的封蓋子清理速度比針扎組慢，但經(jīng)過72 h后基本完全清理。

利用水泡24 h的條件處理，在實際生產(chǎn)中更為方便，在實驗上冰凍和水泡都能達到很好的效果，能判斷蜂群的衛(wèi)生行為；但在實際生產(chǎn)中，利用水泡處理能夠隨時隨地進行，且差異顯著持續(xù)的周期長（48 h），冰凍組為24 h。利用此方法，在抗病育種上我們能夠快速簡便的選擇出清理能力強的抗病蜂群。

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