靈芝孢子多糖提取工藝優(yōu)化*

孟凡冰，李云成，張淑蓉，曾曉漫，鐘耕，2

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

靈芝孢子多糖提取工藝優(yōu)化*

孟凡冰1，李云成1，張淑蓉1，曾曉漫1，鐘耕1，2

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

采用響應(yīng)面分析法對靈芝孢子多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化?？疾?個變量(水料比、超聲溫度、微波時間)對靈芝孢子多糖提取率的影響，并通過響應(yīng)面設(shè)計法確定靈芝孢子多糖提取技術(shù)的最佳工藝條件為水料比20∶1，超聲提取時間為55 min，微波(200 W，60℃)提取時間20 min，在此條件下測得多糖的提取率為2.23%。

靈芝孢子，響應(yīng)面分析法，多糖，提取

靈芝(Ganoderma)，是擔(dān)子菌綱多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganodelma)真菌赤芝(G.lucidum·karst)和紫芝(G.japonicrn L Loyd)的總稱，靈芝孢子(Ganoderma lueidium sp.)是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的袍子，為靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)。它富含蛋白質(zhì)(18.53%)及多種氨基酸(總量為6.1%)，還含有豐富的多糖、萜類、生物堿、維生素等成分。破壁后的靈芝孢子粉具有顯著的藥理作用，它比靈芝實體具有更強(qiáng)、更全面的作用。靈芝孢子粉在抑制腫瘤、增強(qiáng)免疫力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過靈芝子實體，療效相當(dāng)于靈芝子實體的 75 倍［1－2］。

靈芝的多種藥理活性大多和靈芝多糖有關(guān)，目前已分離到的靈芝多糖有200多種。靈芝多糖的主要生物活性有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、降血糖作用、抗輻射作用、抗氧化作用以及促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成［4－8］。靈芝多糖主要分布于靈芝孢子中，毛泉明等［3］比較栽培靈芝與靈芝孢子粉的有效成分含量，結(jié)果表明，靈芝孢子粉的總多糖是栽培靈芝總多糖1.79倍。

目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統(tǒng)的水提醇沉法，還有膜分離法、酶解法、超聲提取方法、微波提取方法等［4］。白在賢等人［8］利用水提醇沉法得到3個品種破壁靈芝孢子的多糖提取率分別為1.062%、1.076%和1.097%。胡斌杰［10］等人用正交超聲提取，得到靈芝子實體多糖提取率為1.92%。但這些方法對靈芝多糖的提取率都相對較低，并且提取溫度較高，不利于靈芝多糖的活性保持。

為了提高靈芝孢子多糖的提取率，避免部分多糖因提取溫度過高而受到破壞和分解［11］，最大限度的保持其活性，本文采用超聲波結(jié)合微波提取法，并在相對較低的溫度下進(jìn)行提取。在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上采用單因素和中心組合實驗，用Box-Behnken軟件繪制響應(yīng)面曲線，并擬合出多元線性回歸方程，以探尋靈芝孢子多糖提取的優(yōu)化參數(shù)，旨在為開辟靈芝孢子多糖綜合提取工藝路線提供理論參考。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

破壁靈芝孢子粉，破壁率達(dá)到99%，由重慶市生物技術(shù)研究所提供，產(chǎn)地為山東泰安。

1.2 儀器與試劑

PHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司;Eppendorf 5810離心機(jī)，德國Eppendorf公司;KQ-250E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;MAS-Ⅱ型常壓微波萃取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;SHZ-D(Ш)型循環(huán)水多用真空泵，鄭州市榮陽華盛儀器廠;R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;UV-2450紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司。

無水乙醇、硫酸、苯酚等所用試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝流程

破壁靈芝孢子粉在50℃下烘干至恒重→稱取1g樣品(精確到0.001g)→體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸提24 h脫脂和除去低聚糖→真空抽濾→取濾渣按水料比加水配料→超聲處理→微波處理(200 W，60℃)→真空抽濾→濾液60℃真空濃縮→濃縮物用95%乙醇4℃醇沉12 h→離心分離(6 000 r/min，15 min)→沉

淀物用50 g水溶解稀釋→取1 mL測定多糖含量

1.3.2 靈芝孢子多糖的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚－硫酸法［12－14］測定靈芝孢子多糖，其多糖提取率計算公式為:

1.3.3 單因素試驗

分別以水料比、超聲時間、微波時間為單因素進(jìn)行試驗，考察各單因素對靈芝孢子多糖提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計［15－18］

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，以靈芝孢子多糖含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面分析因素及水平表

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每個試驗處理重復(fù)3次，以平均值表示，數(shù)據(jù)處理采用Excel和DPS7.05統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗［18－21］

2.1.1 水料比對多糖提取率的影響

參考有關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計單因素水料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，固定超聲時間 40 min，微波時間20 min，按照1.3.1工藝流程進(jìn)行測定，考察水料比對多糖提取率的影響(見圖1)。

由圖1可知，水料比為20∶1時多糖的提取率達(dá)到最高值，當(dāng)水料比大于30∶1時，多糖提取率有所上升，但均低于水料比為20∶1時的多糖提取率。在實際生產(chǎn)過程中，水料比越大，耗時耗能就越多，也不利于后續(xù)的純化工序。故為了方便下一步的濃縮和提純，本試驗選擇水料比為20∶1。2.1.2 超聲時間對多糖提取率的影響

由預(yù)試驗可知，料液在超聲條件下處理60 min后，其提取液的溫度仍不會超過40℃。本實驗設(shè)計單因素超聲時間為20，30，40，50，60 min，固定水料比20∶1，微波時間20 min，按照1.3.1工藝流程進(jìn)行測定，考察超聲提取時間對多糖提取率的影響。由圖2可以看出，隨著超聲時間的延長，多糖的提取率在增大，但是在50 min后，增大效果不明顯(P＞0.05)，為了最大限度的提取到多糖，故將超聲時間設(shè)定在50 min左右。

圖1 水料比對靈芝孢子多糖提取率的影響

圖2 超聲時間對靈芝孢子多糖提取率的影響

2.1.3 微波時間對多糖提取率的影響

在微波條件下，高溫和較大功率容易破壞多糖的結(jié)構(gòu)以及加快多糖降解［20］，從而使多糖活性降低。故本試驗選擇微波溫度為60℃，功率為200 W，這樣能有利于保護(hù)多糖。同時為了降低轉(zhuǎn)移過程對多糖造成的損失，在室溫下直接把用于超聲處理的圓底燒瓶放在微波萃取儀中進(jìn)行萃取。設(shè)計單因素微波時間5，10，15，20，25 min，固定水料比 20∶1，微波時間20 min。按照1.3.1工藝流程進(jìn)行測定，考察微波提取時間對多糖提取率的影響。由圖3以看出，微波時間在20 min左右時多糖的提取率達(dá)到最大，故選擇微波條件為20 min(60℃，200 W)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以水料比X1，超聲時間X2，微波時間X3為自變量，以多糖提取率Y為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，試驗結(jié)果見表2。

圖3 微波時間對靈芝孢子多糖提取率的影響

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及試驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析表

由表3可知，模型的一次項X1、X2、X3極顯著，交互項 X2X3顯著，X1X2、X1X3不顯著，二次項 X12、X2

2、X32都是極顯著，因此各個具體試驗因子與響應(yīng)值都不是簡單的線性關(guān)系。

多糖提取率所建的回歸模型P＜0.01是極顯著的，并且該回歸模型的R2=0.975 1調(diào)整系數(shù)R2=0.943 1，模型與實際試驗失擬項P=0.885 9不顯著，說明試驗擬合較好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點對靈芝多糖提取率進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.2 擬合模型的建立

采用Design-Expert程序?qū)Ρ?所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)過回歸擬合后，解得回歸方程:

2.3 響應(yīng)面圖解

圖4 水料比和超聲時間對靈芝孢子多糖提取率影響的響應(yīng)曲面

圖5 水料比和微波時間對靈芝孢子多糖提取率影響的響應(yīng)曲面

圖6 超聲時間和微波時間對靈芝孢子多糖提取率影響的響應(yīng)曲面

由圖4～圖6可知，超聲時間(X2)對靈芝孢子多糖的提取率影響最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;水料比(X1)與微波時間(X3)次之，表現(xiàn)為曲線稍為平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化不大。

通過軟件分析，多糖提取的最佳條件為水料比為20∶1，超聲時間為55.88 min，微波時間為20.48 min，在此條件下多糖提取率的理論值為2.27%，P=0.933。為了方便實際操作，將提取條件修正為水料比20∶1，超聲時間55 min，微波時間20 min。在此條件下多糖提取的理論值為2.26%，而實際測得的提取率為2.23%，即與理論值的誤差為1.35%，說明實際值與理論值基本相符，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的超聲波結(jié)合微波的提取條件參數(shù)，具有一定的實用價值。

3 結(jié)論

本實驗在低溫即盡可能的保留多糖活性的條件下，利用響應(yīng)面優(yōu)化實驗條件，得到最優(yōu)的提取條件為水料比20∶1，超聲時間55 min，微波時間20 min(200 W，60℃)，在此條件下靈芝糖的提取率達(dá)到了2.23%，具有較強(qiáng)的實用價值，為今后靈芝孢子多糖的工業(yè)化提取提供參考。

［1］ 張偉，曾園山.靈芝孢子的研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2004，2(6):463－465.

［2］ 趙東旭，楊新林，朱鶴孫，等.靈芝孢子研究進(jìn)展［J］.中草藥，1999，30(4):305－307.

［3］ 毛泉明，葉福提，吳倩，等.栽培靈芝與靈芝抱子粉有效成分含量比較［J］.藥學(xué)實踐雜志，1997，15(3):172－173.

［4］ 向俊宇，徐安，夏懋，等.靈芝多糖的研究進(jìn)展.藥學(xué)實踐雜志［J］.2010，28(4):241－244.

［5］ Liu X，Yuan J P，Chung C K，et al.Antitumor activity of the sporoderm－broken germinating spores of Ganoderma lucidum［J］.Cancer Letters，2002，182(2):155－161.

［6］ Shao B M，Dai H，Xu W，et al.Immune receptors for polysaccharides from Ganoderma lucidum［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，323(1):133－141.

［7］ Zhang H N，Lin Z B.Hypoglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides［J］.Acta Pharmacologica Sinica，2004，25(2):191－195.

［8］ 楊睿悅，裴新榮，張召鋒，等.海洋蛋白肽及其與靈芝多糖配伍的防輻射作用實驗研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(5):1－5.

［9］ 白在賢，周雪梅，韓塔娜，等.破壁靈芝孢子粉中多糖的含量測定［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2006，4(2):36－39.

［10］ 胡斌杰，韓艷霞，姬紅.正交實驗法超聲提取靈芝多糖最佳工藝研究［J］.中藥材，2008，31(1):142－143.

［11］ 陳小強(qiáng)，張志發(fā)，王川丕，等.熱處理對高溫煎煮和低溫酶法提制綠茶多糖的影響［J］.應(yīng)用化學(xué)，2011，28(3):444－456.

［12］ 李艷，趙海燕，呂建寧.靈芝多糖提取工藝研究［J］.中成藥，2006，28(7):1 052－1 054.

［13］ 張志軍，劉建華，李淑芳，等.靈芝多糖含量的苯酚硫酸法檢測研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(2):193－195.

［14］ 李堅，劉東波，夏志蘭，等.分光光度法快速測定靈芝中多糖含量［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(2):34－38.

［15］ Lee S，Bae H，Kim N，et al.Optimization of growth conditions of Lentinus edodes Mycelium on corn processing waste using response surface analysis［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2008，105(2):161－163.

［16］ Li Q H.，F(xiàn)u C L.Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein［J］.Food Chemistry，2005，92(4):701 －706.

［17］ Ferreira S L，Bruns R E，F(xiàn)erreira H S，et al.Box－Behnken design:An alternative for the optimization of analytical methods［J］.Analytica Chimica Acta，2007，597(2):179－186.

［18］ 劉春泉，宋江峰，李大婧，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)選靈芝子實體多糖的提取工藝［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，23(3):239－243.

［19］ 董艷紅，李姝婧，鄭惠華，等.響應(yīng)曲面優(yōu)化超聲波提取靈芝多糖工藝研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(6):98－101.

［20］ 李國香，戴軍，朱松.等.微波輔助法提取赤靈芝孢子多糖及其相對分子質(zhì)量分布分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(12):168－172.

［21］ 張艷榮，單玉玲，劉婷婷，等.微波萃取技術(shù)在姬松茸多糖提取中的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2006，27(12):267－270.

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Ganoderma Lucidum Spore by Response Surface Analysis

Meng Fan-bing1，Li Yun-cheng1，Zhang Shu-rong1，Zeng Xiao-man1，Zhong Geng1，2*
1(College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China)
2(Engineering Technique Research Center of Chongqing for Special Food，Chongqing 400715，China)

This paper describes the optimization of extraction process of polysaccharides from Ganoderma lucidumspore by response surface analysis.The effects of three independent variables(namely，ratio of water to material，ultrasonic extraction time and microwave-assisted extraction time)on the yield of polysaccharides from Ganoderma lucidumspore were evaluated.Extraction ratio of water to material of 20:1，ultrasonic extraction time of 55 min，microwave-assisted extraction time of 20 min and were found optimum.Under these optimized conditions，the experimental value of Polysaccharides yield was 2.23%.

Ganoderma lucidum spore，response surface analysis，polysaccharides，extraction

碩士研究生(鐘耕教授為通訊作者，E-mail:zhonggdg@126.com)。

*重慶市科技攻關(guān)計劃項目(CSTC，2009AC5183)

2011－07－13，改回日期:2011－10－25