殷治華 趙富璽 穆雅琴 劉潤花 王健 馮婷婷 齊彥

妊娠是極其復(fù)雜的生理過程，近代生殖免疫學(xué)研究認(rèn)為，正常妊娠的維持有賴于母胎免疫耐受的形成［1］，一旦母胎免疫失衡，可能發(fā)生原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)的病理妊娠。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)對于母體免疫耐受胎兒必不可少，是調(diào)控母胎免疫耐受形成的重要因素［2］。

在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的研究中，探討Treg細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子FoxP3對細(xì)胞因子受體表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，我們是以孕鼠(流產(chǎn)模型和正常對照)脾臟淋巴細(xì)胞為研究對象的，我們可以通過CD熒光抗體標(biāo)記后，再以免疫磁珠細(xì)胞分選法(MACS)或流式細(xì)胞分選法(FACS)獲得Treg細(xì)胞。因此，建立有效的流產(chǎn)模型孕鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離技術(shù)是進(jìn)行這些研究的先決條件。本文采用免疫磁珠細(xì)胞分選法對流產(chǎn)模型孕鼠脾臟Treg細(xì)胞進(jìn)行分離，并對流產(chǎn)模型孕鼠脾臟Treg細(xì)胞的純度和活性及獲得率進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 研究對象 經(jīng)與雄性DBA/2J孕鼠(購自北京華阜康公司)交配受孕的雌性CBA/J孕鼠(購自上海斯萊克公司)，飼養(yǎng)于山西大同大學(xué)免疫研究所動物室。

1.2 主要試劑 小鼠淋巴細(xì)胞分離液;紅細(xì)胞裂解液;小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞磁珠分選試劑盒;大鼠抗小鼠CD4-FITC標(biāo)記、大鼠抗小鼠CD25-PE標(biāo)記的單克隆抗體，MS磁珠分選柱、LD磁珠分選柱。

1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀:美國BD FACS Calibur;超靜工作臺:新加坡ESCO;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS CKX-31;二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱:國產(chǎn)上海博訊HH.CP-01A;低溫冷凍臺式離心機(jī):國產(chǎn)湖南賽特湘儀TGL-20 m;免疫磁珠磁力架、MidiMACS分選器和MiniMACS分選器:德國MACS Miltnyi Biotec。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 孕鼠脾臟研磨與脾細(xì)胞懸液制備 孕鼠懷孕第9天頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡3 min，將孕鼠置于無菌紙上，左腹側(cè)朝上，放于無菌超凈臺中;在孕鼠左腹側(cè)中部剪開孕口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟;在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪無菌分離脾臟下面的結(jié)締組織，取出脾臟，放入盛有5 ml Hank's液的培養(yǎng)皿中;制備脾細(xì)胞懸液:篩網(wǎng)研磨法:將脾臟放置篩網(wǎng)上，用2 ml注射器針芯輕輕研壓脾臟，獲細(xì)胞懸液;收集制備好的脾細(xì)胞懸液，1800rpm 4℃離心8 min;棄上清，重懸細(xì)胞，加5 ml ELS(紅細(xì)胞裂解液)，混勻，室溫靜置5 min;加Hank's液至10 ml，混勻，1800 rpm 4℃離心8 min;棄上清，加Hank's液至10 ml，混勻，篩網(wǎng)過濾，1800 rpm 4℃離心8 min，棄上清;5 ml RPMI 1640 重懸細(xì)胞;計(jì)數(shù):190 μl臺盼蘭 +10 μl細(xì)胞懸液，混勻，取10 μl滴于計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)2個相對大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度到108mol/L。

1.4.2 免疫熒光抗體標(biāo)記及磁珠分選 磁珠陽性分選CD+4T 細(xì)胞:1 ×108個細(xì)胞用100 μl的1640 重懸，加入10 μl CD4-FITC，混勻，4℃ ～8℃孵育 15 min，再加入 1 ml RPMI，混勻，1000 r/min離心10 min，棄上清，重懸于80 μl的1640中。細(xì)胞懸液中加入40 μl CD4磁珠，混勻4℃ ～8℃孵育20 min，buffer洗滌后1000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀，用500 μl buffer重懸。將LD磁珠分選柱置于分選器中，2 ml buffer過柱，然后將細(xì)胞懸液加入其中，收集從分選柱中流出的細(xì)胞，得到CD4+細(xì)胞。

磁珠陽性分選CD+CD+T細(xì)胞和陰性分選CD+CD-425425T細(xì)胞:計(jì)數(shù)從分選柱中流出的CD4+T細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度，得量為 1 ×107個細(xì)胞。用 90 μl buffer重懸，加入 10 μL CD25磁珠，混勻，4～8℃孵育15 min，將MS磁珠分選柱置于分選器中，500 μl buffer過柱，然后將細(xì)胞懸液加入其中，用3 500 μl buffer洗柱，收集流下來的細(xì)胞懸液和洗柱液，此收集液即為CD4+CD25-T細(xì)胞，留作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)用。然后將柱子放入收集管中，移開磁場，向柱子中再加入1 ml buffer，用塞子快速將磁珠標(biāo)記的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞沖出柱子。

細(xì)胞計(jì)數(shù):190 μl臺盼蘭 +10 μl細(xì)胞懸液，混勻，取10 μl滴于計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)2個相對大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。觀察細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下:細(xì)胞存活率=染色陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)100%。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測 取1 105個細(xì)胞用抗CD4-FITC、抗CD25-PE的抗體雙色標(biāo)記，室溫避光孵育30 min后，用PBS液洗滌重懸，上流式細(xì)胞儀檢測分選的CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-細(xì)胞T的純度。

2 結(jié)果

流產(chǎn)模型孕鼠脾臟細(xì)胞經(jīng)過多次免疫磁珠細(xì)胞分選法兩步分選得到CD4+/CD25

+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞純度為(93.51.1)%，T細(xì)胞純度為(96.60.6)%，如圖1、圖2。

圖1 分選后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，CD4+/CD25+

圖2 分選后的CD4+/CD25-細(xì)胞

3 討論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是一類具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體，其可能通過抑制CD4+/CD8+T細(xì)胞，B細(xì)胞增生，抑制抗原提呈細(xì)胞(APC)，如子宮樹突狀細(xì)胞(uDCs)和單核細(xì)胞成熟，抑制子宮NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，以及Ig、細(xì)胞因子的產(chǎn)生等來維持母體對孕體的免疫耐受［3］，Zenclussen 等［4，5］發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)模型小鼠中 Treg 細(xì)胞在數(shù)量和功能上比正常妊娠模型小鼠都顯示有一定程度的下降，妊娠誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞在母胎耐受中起到了至關(guān)重要的作用，由于該類細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的機(jī)理尚未得到完全闡明，因此分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增Treg細(xì)胞，已成為目前研究母胎免疫耐受的重要內(nèi)容之一。

實(shí)驗(yàn)中如何獲得大量Treg細(xì)胞是進(jìn)行研究的前提條件。我們采用密度梯度離心法，從孕鼠脾臟組織中分離外周血單個核細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、少量的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及混雜的紅細(xì)胞和血小板。其原理是利用各種細(xì)胞大小、密度、表面電荷、黏附能力等的差異進(jìn)行分離［6］，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠淋巴細(xì)胞分離液作為分離純化試劑。

對于用于體外擴(kuò)增的Treg細(xì)胞，目前常用的分選方法是免疫磁珠分選和流式細(xì)胞分選。免疫磁珠分選一般用CD4、CD25抗原作為分選標(biāo)記來純化小鼠的Treg細(xì)胞，其原理是將包被有關(guān)抗體的磁珠與待分離細(xì)胞充分作用，這樣借助于抗體磁珠，將與相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合成:細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物，該細(xì)胞在磁場中運(yùn)動與其他細(xì)胞產(chǎn)生明顯差別。如采用層析的方法，將層析柱放于強(qiáng)磁場中，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞運(yùn)動將受限，而未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞將先被洗脫下出來，再將該柱移出磁場，與結(jié)合的細(xì)胞也將被洗脫下來，達(dá)到分離目的。

免疫磁珠分選和常用的流式細(xì)胞分選相比，具有快速、高效、對靶細(xì)胞的活性和功能干擾少的優(yōu)點(diǎn)，流式細(xì)胞分選雖然可以同時對2個甚至更多的CD熒光抗體標(biāo)記信號一次性進(jìn)行分選，分離純度高，但分離速度慢，細(xì)胞最終獲得率低，對細(xì)胞損傷較大，對于功能性的表面分子有激惹作用。綜合看來，我們采用免疫磁珠兩步分選來得到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和T細(xì)胞，對于孕鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離純化，取得較好的分離效果，細(xì)胞純度和活性均較高，為通過流產(chǎn)模型孕鼠(和正常對照)來進(jìn)行復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

［1］Tafuri A，Alferink J，Moller P，et al.T cell awareness of paternal alloantigena during pregnancy.Science，1995，270(5236):630-633.

［2］邱麗華，林其德.調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究.中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39(12):816-818.

［3］Zhao FX，Zhang YY，Liu RH，et al.Effect of CD86 blockage on the expressions of TGF-＆1，MMP-9，TIMP-3 and PAI-1 proteins and outcome of pregnancy in murine abortion-prone model.J Microbiol Immunol，2006，4(2):137-145.

［4］Zenclussen A C，Gerlof K，Zenclussen M C，et al.Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion:Adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+T regulatory cells prevents fet al rejection in a murine abortion model.Am J Pathol，2005，166(3):811-822.

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［6］張誠，陳幸華，張曦，等.不同明膠濃度及淋巴細(xì)胞分離液對人臍血源黏附細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2008，16(6):1437-1441.