HPLC法測(cè)定雙黃連制劑中連翹苷的含量

代雪平，宋漢敏（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450003）

雙黃連類(lèi)制劑處方由金銀花、黃芩、連翹3味藥材組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效，用于外感風(fēng)熱所致的感冒，有口服液、片劑、栓劑、顆粒劑、注射劑等劑型，以口服液和注射劑生產(chǎn)量和使用量最大。由于雙黃連類(lèi)制劑所致不良反應(yīng)較多[1]，對(duì)該類(lèi)藥品質(zhì)量控制的研究也日益增多，其中連翹的主要有效成分連翹苷的測(cè)定多采用高效液相色譜（HPLC）法[2]。2010年版《中國(guó)藥典》（一部）[3]（雙黃連口服液）及衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[4]（雙黃連注射液）規(guī)定，連翹含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液制備方法為柱層析法，方法操作流程為：精密量取本品15 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，微熱使溶解，加中性氧化鋁1 g拌勻，加于中性氧化鋁柱（100～120目，10 g，內(nèi)徑2 cm）上，用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮近干，殘?jiān)?0%甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。該方法共10個(gè)操作步驟，非常煩瑣，且耗時(shí)較長(zhǎng)（測(cè)定周期約2個(gè)工作日），不能適應(yīng)日常檢驗(yàn)工作需要。筆者經(jīng)過(guò)分析處方后發(fā)現(xiàn)，影響連翹苷測(cè)定的主要是黃酮類(lèi)（以黃芩苷為代表）和有機(jī)酸類(lèi)（以綠原酸為代表）等酚酸性成分，而連翹苷為木脂素類(lèi)化合物，分子結(jié)構(gòu)中無(wú)游離酚羥基或羧基，利用這一結(jié)構(gòu)差異，革除柱層析方法，采用直接稀釋后的樣品溶液進(jìn)樣，采用弱堿性流動(dòng)相，使黃芩苷等酚酸類(lèi)成分成鹽后在色譜柱上基本不保留，出峰較快，而連翹苷出峰時(shí)間不受影響，可以使連翹苷和其他干擾性成分得到較好分離?，F(xiàn)將方法報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型HPLC儀，包括G1314 A VWD型紫外檢測(cè)器、G1312 A型自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent Chemstation化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；Mettler Toledo十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒公司）。

連翹苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110821-200610）；雙黃連口服液（河南福森藥業(yè)有限公司，批號(hào)：110234；河南天地藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20110114）；雙黃連注射液（河南福森藥業(yè)有限公司，批號(hào)：0910001、100974、1012101、1105051-1、1105091-1、1105101-1、1106351-1、1106361-1、1106371-1、1106381-1、1106401-2、1106421-2、1106431-2、1106441-2、1106451-2、1106571-3、1106581-3、1106591-3）；乙腈（德國(guó)Merck公司，色譜純）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.012 mol·L－1醋酸鈉溶液（v/v＝23∶77）；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；流速：1 mL·min－1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜見(jiàn)圖1。理論板數(shù)按連翹苷計(jì)算應(yīng)不低于4000。由圖1可見(jiàn)，在改進(jìn)后的色譜條件下，供試品溶液中其他成分對(duì)連翹苷測(cè)定無(wú)干擾。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取連翹苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇制成每1 mL含0.110 mg的對(duì)照品貯備液，精密吸取貯備液10mL，置于50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 雙黃連口服液：精密吸取雙黃連口服液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。雙黃連注射液：精密吸取雙黃連注射液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 除連翹外，其余各味按處方比例取樣，分別照雙黃連口服液和注射液“制法”項(xiàng)下規(guī)定，制備缺連翹的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下連翹苷對(duì)照品貯備液各1、2、5、10、20、30、40、50 μL，分別注入HPLC儀，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定連翹苷峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝6.6954×102 X+3.9099（r＝0.9999）。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在0.11～5.5 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線基本過(guò)原點(diǎn)，故采用“外標(biāo)一點(diǎn)法”測(cè)定含量。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液（濃度為22 μg·mL－1）10 μL，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定連翹苷色譜峰峰面積，重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定并計(jì)算峰面積。結(jié)果，連翹苷峰面積RSD＝0.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取雙黃連注射液（批號(hào)：0910001）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于第0、1、2.5、4、5、6、7、8.5 h進(jìn)樣1次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定并計(jì)算峰面積。結(jié)果，連翹苷峰面積RSD＝1.7%（n＝8），表明供試品溶液在8.5 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取雙黃連注射液（批號(hào)：0910001）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，測(cè)定連翹苷含量，測(cè)定6次。結(jié)果，連翹苷平均含量為0.116 mg·mL－1，RSD＝1.7%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的雙黃連注射液（批號(hào)：0910001，連翹苷含量：0.116 mg·mL－1）適量，共6份，每份5 mL，置于50 mL容量瓶中，分別精密加入連翹苷對(duì)照品貯備液（連翹苷含量：0.110 mg·mL－1）5 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，測(cè)定連翹苷含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。連翹苷平均加樣回收率為98.8%，RSD＝0.3%（n＝6）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

取雙黃連口服液和雙黃連注射液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定連翹苷含量，同時(shí)按照2010年版《中國(guó)藥典》（一部）（雙黃蓮口服液）及衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（雙黃蓮注射液）方法測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表2（2種方法測(cè)定結(jié)果基本一致）。

3 討論

雖然現(xiàn)代色譜柱填料制造及裝填技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)使液相色譜柱的pH適應(yīng)范圍有了更大的拓展，但十八烷基硅烷鍵合硅膠填料的化學(xué)本質(zhì)決定了填料在堿性流動(dòng)相環(huán)境下的不穩(wěn)定性。醋酸鈉為弱酸強(qiáng)堿鹽，其水溶液呈弱堿性，并在一定的范圍內(nèi)對(duì)酸和堿有緩沖作用。筆者考察了不同濃度的醋酸鈉溶液的pH值，結(jié)合不同濃度的醋酸鈉溶液色譜分離效果，最后確定0.012 mol·L－1醋酸鈉溶液（pH 6.6）為最優(yōu)，既可以滿(mǎn)足使黃芩苷等酚酸類(lèi)成分成鹽解離而快速洗脫的目的，同時(shí)對(duì)色譜柱填料的影響最小。

本文采用含醋酸鈉溶液流動(dòng)相替代原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的酸性流動(dòng)相，消除了其他成分對(duì)連翹苷在色譜柱分離過(guò)程中的干擾，因而簡(jiǎn)化了連翹苷供試品溶液制備方法，極大地提高了檢測(cè)效率，改進(jìn)后的方法連翹苷測(cè)定結(jié)果與原方法測(cè)定結(jié)果基本一致，且重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，精密度、加樣回收率均符合要求，說(shuō)明改進(jìn)后的方法完全可以替代原方法。

[1]方世平，楊寶玉.雙黃連粉針劑不良反應(yīng)117例分析[J].中國(guó)藥房，1998，9（4）：176.

[2]聶東東，楊立娟，宋維秋.HPLC法測(cè)定雙黃連制劑中連翹苷的含量[J].中國(guó)藥房，2000，11（6）：275.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：611.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-中藥成方制劑第十一冊(cè)[S].WS3-B-2104-96.1996：38.