莓葉委陵菜醇提物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

閔運(yùn)江，陳澍潭

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 六安237012）

莓葉委陵菜（Potentilla fragarioides L.），為薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬（Potentilla）多年生草本植物［1-2］，別名雉子筵、毛猴子、菜飄子、滿(mǎn)山紅等。其根極多；莖直立或傾斜，簇生叢狀，莖葉有長(zhǎng)柔毛；基生葉為成叢生狀，奇數(shù)羽狀復(fù)葉，葉柄有開(kāi)展的疏長(zhǎng)柔毛，小葉5～9枚，上部小葉較下部的大。頂生傘房狀聚傘花序，花多，黃色；瘦果小，近腎形。常生長(zhǎng)于草地、溝邊、灌叢及疏林下。

莓葉委陵菜主產(chǎn)江蘇、浙江、江西、山東及安徽等省。其植株中的生物活性成分含量豐富，其中總黃酮含量，顯著高于已被廣泛研究的銀杏葉中黃酮含量。據(jù)初步研究，安徽產(chǎn)委陵菜屬植物各種類(lèi)的全草都含黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、有機(jī)酸等［3］，均可藥用，已有報(bào)道的委陵菜（Potentilla chinensis Ser.）、三葉委陵菜（Potentilla freyniana Bornm.）等三萜類(lèi)成分含量較高，有清熱解毒、涼血止血等功能［4-5］。黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)等化合物具有較強(qiáng)生物活性，能防治血管硬化和降低心肌耗氧量等；也是天然抗氧化劑，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老、抗癌防癌等，在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［6-10］。有研究表明，三萜類(lèi)有顯著抗病毒活性［11-12］。此外，莓葉委陵菜因其花色鮮黃而艷麗，繁殖力強(qiáng)而在城市園林綠化中常被用作地被植物。而對(duì)于莓葉委陵菜的乙醇提取物急性毒性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究即是用新制備的莓葉委陵菜乙醇提取物給實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃，觀(guān)察其急性毒性反應(yīng)，從而為莓葉委陵菜的藥用開(kāi)發(fā)利用提供初步的安全性參考數(shù)據(jù)。

1 材料、方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用小鼠為南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的昆明種小鼠，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2002-0031，雌雄各占50%，體重20±2g。正式試驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 儀器、試劑

TU-1201紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，HH—4恒溫水浴鍋，40目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，101AS-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱，超聲波破碎儀，加熱回流裝置；乙醇，乙醚，等；試劑均為AR級(jí)。

1.3 莓葉委陵菜乙醇提取物的制備

1.3.1 莓葉委陵菜的處理

新鮮莓葉委陵菜根采于六安市小華山荒地林緣，新鮮材料先經(jīng)105℃殺青15min，70℃烘至近干，剪成2～3mm小段，再用103℃烘干。干樣品磨成粉末，過(guò)40目篩后的粉末于103℃烘至恒重，干燥器中冷卻，備用。

1.3.2 脫脂

Soxhlet提取法，45℃下無(wú)水乙醚脫脂約20h，待充分除去樣品中脂類(lèi)和脂溶性色素后取出樣品濾紙包，吹干乙醚，103℃烘干，備用。

1.3.3 浸提

脫脂后的材料，置于三角燒瓶中，搗碎并加入80%乙醇（V／V），80℃水浴中回流浸提10次，每次浸提2h，第一次浸提固液比為1∶5（g∶ml），其后各次浸提的固液比為1∶3，最后一次浸提的乙醇浸提液幾乎為無(wú)色，表明已浸提充分。合并10次浸提液于分液漏斗中，加適量石油醚，充分震蕩，靜置，棄去石油醚層，以進(jìn)行二次脫脂，收集脫脂處理后的含粗黃酮和三萜類(lèi)物質(zhì)的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，至一定體積后取出，移于燒杯內(nèi)。

1.3.4 制備乙醇提取物

將上述燒杯中的浸提液，在90℃水浴中加熱濃縮，至注射器能抽動(dòng)的最大濃度，即為實(shí)驗(yàn)用莓葉委陵菜乙醇提取物。換算該乙醇提取物，每ml提取物相當(dāng)于3.6g新鮮莓葉委陵菜原料。依據(jù)文獻(xiàn)方法［13］，測(cè)定提取物中黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)的含量，提取物中含三萜類(lèi)和黃酮類(lèi)總量為36.0mg／ml。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

依文獻(xiàn)方法［14-15］，選取體重20±2g的小鼠20只，隨機(jī)分為2組，每組雌雄各半，分別為給藥組和空白對(duì)照組。給藥組小鼠分別在頭、背、尾部用黑色記號(hào)筆標(biāo)注，記錄為1～10號(hào)。灌胃前禁食不禁水16 h，按每kg小鼠體重給予莓葉委陵菜乙醇提取物20 ml劑量灌胃；灌胃后，連續(xù)觀(guān)察小鼠7d，記錄其活動(dòng)、飲食、毛發(fā)、大小便和死亡情況等，解剖觀(guān)察死亡小鼠的心、肺、肝、腎、脾等主要器官的組織變化；未死亡的小鼠，實(shí)驗(yàn)第8d稱(chēng)其體重后處死，解剖觀(guān)察其心、肝、脾、肺、腎等主要器官的組織變化。

2 結(jié)果

2.1 莓葉委陵菜乙醇提取物對(duì)小鼠體征的影響

小鼠給予莓葉委陵菜乙醇提取物21.50g／kg灌胃后10min內(nèi)，與對(duì)照組小鼠比較，均表現(xiàn)為活動(dòng)減少，精神不佳；10min后，小鼠活動(dòng)恢復(fù)正常，應(yīng)為灌胃刺激的影響所致；連續(xù)觀(guān)察7d，存活的受試小鼠的飲食、毛色、活動(dòng)及大小便均正常，眼、鼻、口腔未見(jiàn)異常分泌物，無(wú)不良癥狀出現(xiàn)。

2.2 給藥前后小鼠體重的變化

各組小鼠的體重及其變化情況見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，給藥組小鼠體重平均增重6.6g，而空白對(duì)照組小白鼠的體重增重7.1g，考慮到灌胃影響，尤其是灌胃初期對(duì)其食欲的影響，可認(rèn)為藥物對(duì)其體重增重?zé)o顯著影響。

表1 莓葉委陵菜醇提物對(duì)試驗(yàn)小鼠體重的影響

2.3 小鼠死亡狀況

灌胃后7d，給藥組小鼠有一只在給藥后1min內(nèi)死亡，經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)是由于灌胃時(shí)注射器針頭插進(jìn)了胸腔里，導(dǎo)致胸腔破裂等機(jī)械性致死，屬于操作不當(dāng)致死，其余試驗(yàn)小鼠均正常，未出現(xiàn)給藥后死亡的情況。

2.4 對(duì)小鼠心、肝、肺、腎、脾等臟器的影響

處死所有試驗(yàn)后的小鼠，解剖各組實(shí)驗(yàn)小鼠心、肺、肝、腎、胃、脾等主要臟器，均未見(jiàn)異常病變。

由以上試驗(yàn)可知，莓葉委陵菜醇提物21.50g／kg灌胃小鼠，對(duì)小鼠均無(wú)影響，表明莓葉委陵菜乙醇提取物對(duì)小鼠的LD50大于21.50g／kg。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)委陵菜屬植物的研究，大多是針對(duì)其性狀、產(chǎn)地分布、種屬分類(lèi)及栽培技術(shù)等方面，國(guó)外有其抗病毒活性的研究。對(duì)莓葉委陵菜醇提物的急性毒性研究，是為其藥用、食用時(shí)對(duì)人體是否有毒副作用的基本要求之一。根據(jù)保健食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，本研究將小白鼠分為2組，每組10只，雌雄各半，分為給藥組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)觀(guān)察結(jié)果，只有1只由于操作不當(dāng)致其死亡，其余小鼠灌胃后的活動(dòng)、飲食、糞便、毛發(fā)和精神狀態(tài)等方面，均無(wú)異常表現(xiàn)，未見(jiàn)任何急性中毒癥狀或藥物致死現(xiàn)象，表明試驗(yàn)小鼠在灌胃莓葉委陵菜乙醇提取物20ml／kg，即720mg／kg的情況下，未出現(xiàn)急性中毒癥狀。因此，小鼠對(duì)受試物的LD50大于21.50g／kg，表明莓葉委陵菜乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠無(wú)毒副作用［11-12］。

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