王麗萍, 金 鑫, 黃 磊, 李鵬飛, 王立成

(1. 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012; 2. 吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012)

DAF-16(abnormal dauer formation-16)是叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXO在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的同源蛋白, 可調(diào)節(jié)秀麗線蟲(chóng)壽命[1-2]. DAF-16蛋白在正常情況下位于細(xì)胞質(zhì)中, 可在不同脅迫條件下被信號(hào)蛋白激活, 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中, 提高秀麗線蟲(chóng)的應(yīng)激能力, 延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)在脅迫環(huán)境下的壽命[3]. DAF-16下游的sod-3以活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)為底物, 將對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為更安全的化合物, 其活性與秀麗線蟲(chóng)過(guò)氧化損傷引起的衰老情況相關(guān)[4].sod-3轉(zhuǎn)錄受DAF-16調(diào)控, 因此可將SOD-3表達(dá)量作為DAF-16轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)指標(biāo).

次血紅素六肽(deuterohaemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys, DhHP-6)為吉林大學(xué)生物大分子研究室設(shè)計(jì)合成的一種抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的新型模擬酶[5]. DhHP-6可延長(zhǎng)野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)平均壽命, 提高秀麗線蟲(chóng)的耐熱和抗氧化損傷等應(yīng)激能力[6-7]. 本文通過(guò)上調(diào)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)某些信號(hào)通路中一系列抗脅迫基因的表達(dá)量, 清除了自由基, 從而延長(zhǎng)了秀麗線蟲(chóng)壽命.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

野生型秀麗線蟲(chóng)(N2)、 TJ356(DAF-16∷GFP)突變體秀麗線蟲(chóng)、 CF1038(daf-16缺失)突變體秀麗線蟲(chóng)、 CF1553(SOD-3∷GFP)突變體秀麗線蟲(chóng)和大腸桿菌OP50.

DhHP-6由吉林大學(xué)生物大分子研究室自主固相肽合成; DCFH-DA為美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品; 胰蛋白胨、 瓊脂和粉酵母抽提物均為北京鼎國(guó)生物工程公司產(chǎn)品; 膽固醇、 氯化鈉、 硫酸鎂、 氯化鈣、 無(wú)水乙醇和氫氧化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1 秀麗線蟲(chóng)的培養(yǎng)方法 秀麗線蟲(chóng)以一種特殊的尿嘧啶缺陷型大腸桿菌OP50(E.coliOP50)為食, 該菌株在秀麗線蟲(chóng)NGM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢, 可保證秀麗線蟲(chóng)有穩(wěn)定的食物供給.

在細(xì)菌培養(yǎng)板(LB)上挑取單菌落至5 mL的LB液體培養(yǎng)基中, 于37 ℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)8～12 h, OD600=0.4～0.6. 吸取適量的菌液(350 μL/90 mm平板)滴于NGM培養(yǎng)基上, 用滅菌的涂布棒均勻涂抹于NGM培養(yǎng)基的中間部位. 涂抹面積約占總表面積的20%～50%, 以防止秀麗線蟲(chóng)爬到器壁邊緣而不易操作和觀察. 涂抹完畢后室溫放置至菌液被NGM完全吸收, 轉(zhuǎn)到20 ℃的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 使菌長(zhǎng)成薄薄的一層, 供秀麗線蟲(chóng)食用.

1.2 秀麗線蟲(chóng)壽命的測(cè)定方法 使用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)秀麗線蟲(chóng). 挑取單個(gè)同期化培養(yǎng)至L4期雌雄同體的秀麗線蟲(chóng)至涂有OP50菌液的NGM培養(yǎng)基上, 20 ℃培養(yǎng). 在產(chǎn)卵期內(nèi), 需每日將秀麗線蟲(chóng)挑取到新的培養(yǎng)基以防止幼蟲(chóng)過(guò)多影響成蟲(chóng)的生長(zhǎng)； 產(chǎn)卵期過(guò)后改為每2～3 d換一次. 以秀麗線蟲(chóng)卵孵化為起始, 以末端刺激無(wú)生命活動(dòng)記為秀麗線蟲(chóng)死亡, 秀麗線蟲(chóng)壽命期記為從起始到死亡的時(shí)間, 分別記錄各實(shí)驗(yàn)組秀麗線蟲(chóng)壽命情況.

1.3 DAF-16的GFP熒光顯微檢測(cè)及SOD-3的熒光定量檢測(cè) 分別挑取30只產(chǎn)卵期的TJ356和CF1553秀麗線蟲(chóng)至直徑90 mm涂有OP50的NGM平板上, 產(chǎn)卵3 h, 將成蟲(chóng)移走, 完成秀麗線蟲(chóng)的同期化. 產(chǎn)完卵的平板于20 ℃培養(yǎng)4 d. 分別挑取TJ356和CF1553秀麗線蟲(chóng)成蟲(chóng)(表現(xiàn)為扭曲或滾筒性爬動(dòng))進(jìn)行分組, 并用DhHP-6進(jìn)行給藥處理, 將處理生長(zhǎng)時(shí)間為6 d的秀麗線蟲(chóng)進(jìn)行壓片觀察.

先分別將DAF-16∷GFP和SOD-3∷GFP秀麗線蟲(chóng)模型用左旋咪唑麻醉, 再分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂制片, 挑到載片上, 每片15～20只, 滴加M9緩沖溶液20～50 μL, 加蓋玻片, 壓片. 用共聚焦激光掃描熒光顯微鏡檢測(cè)TJ356秀麗線蟲(chóng)DAF-16的GFP熒光; 用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)CF1553秀麗線蟲(chóng)的GFP綠色熒光強(qiáng)度.

1.4 DCF法檢測(cè)ROS 同期培養(yǎng)至L4期的野生型N2秀麗線蟲(chóng), 挑取單個(gè)雌雄同體的秀麗線蟲(chóng)至涂有OP50菌液的NGM培養(yǎng)基上, 于20 ℃培養(yǎng)4 d, 進(jìn)行分組, 并用DhHP-6進(jìn)行給藥處理, 將處理培養(yǎng)時(shí)間分別為4,6,8 d的秀麗線蟲(chóng)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè).

將5 mg DCFH-DA用DMSO配置為1 mmol/L的儲(chǔ)液, 并于-20 ℃分裝避光儲(chǔ)存, 備用. 向96孔酶標(biāo)板每孔加入200 μL的M9緩沖溶液, 將成年秀麗線蟲(chóng)挑入96孔酶標(biāo)板, 每孔30只, 每組平行3孔, 加入DCF使其濃度為10 μmol/L, 在室溫避光條件下培養(yǎng)30 min后, 使用熒光酶標(biāo)法測(cè)定DCF的熒光強(qiáng)度, 進(jìn)而確定ROS的濃度.

1.5 數(shù)據(jù)分析 使用Graphpad Prism 5.0及Origin 6.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 DhHP-6對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響 挑取單個(gè)同期培養(yǎng)至L4期雌雄同體的秀麗線蟲(chóng)至涂有OP50菌液的NGM培養(yǎng)基上, 于20 ℃培養(yǎng)4 d, 將秀麗線蟲(chóng)分為對(duì)照組和100 μmol/L濃度DhHP-6給藥組繼續(xù)培養(yǎng). 以秀麗線蟲(chóng)卵孵化為起始, 以末端刺激無(wú)生命活動(dòng)記為秀麗線蟲(chóng)死亡, 秀麗線蟲(chóng)壽命期為起始到死亡的時(shí)間. 選擇N2野生型秀麗線蟲(chóng)及CF1038缺陷型秀麗線蟲(chóng)進(jìn)行研究.

表1列出了20 ℃下DhHP-6對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響. 由表1可見(jiàn), 100 μmol/L DhHP-6可延長(zhǎng)野生型秀麗線蟲(chóng)壽命, 野生型平均壽命為(16.2±0.53)d, 最大壽命為26 d. 給藥后, 秀麗線蟲(chóng)平均壽命為(19.7±0.26)d, 最大壽命為27 d, 延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)平均壽命為21%. DAF-16缺陷的CF1038型秀麗線蟲(chóng)平均壽命為(12.8±0.51)d, 給藥后, CF1038秀麗線蟲(chóng)平均壽命為(11.2±0.49)d.

表1 20 ℃下DhHP-6對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響

*與對(duì)照組相比存在顯著差異,p<0.001; **與對(duì)照組相比存在顯著差異,p<0.01.

圖1 DhHP-6對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響Fig.1 Effect of DhHP-6 on C.elegans lifespan

DhHP-6對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響如圖1所示. 由圖1可見(jiàn), 野生型秀麗線蟲(chóng)給藥前后的生存曲線不同, 表明100 μmol/L的DhHP-6可延長(zhǎng)野生型秀麗線蟲(chóng)的壽命, 但未影響CF1038缺陷性秀麗線蟲(chóng)的壽命, 即DhHP-6延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)壽命的機(jī)制與DAF-16有關(guān).

2.2 DAF-16細(xì)胞核定位 DAF-16正常情況下位于細(xì)胞質(zhì)中, 在脅迫環(huán)境下被不同的蛋白激活, 進(jìn)入細(xì)胞核行使轉(zhuǎn)錄因子功能, 啟動(dòng)下游基因表達(dá), 從而提高秀麗線蟲(chóng)應(yīng)激能力, 延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)在脅迫環(huán)境下的壽命. 綠色熒光蛋白(GFP)在特定波長(zhǎng)激發(fā)下可產(chǎn)生綠色熒光, 本文通過(guò)DAF-16與GFP融合表達(dá)的TJ356缺陷性秀麗線蟲(chóng)進(jìn)行DAF-16細(xì)胞核定位實(shí)驗(yàn), 研究DhHP-6調(diào)節(jié)DAF-16延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)壽命的分子機(jī)制. DAF-16細(xì)胞核定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見(jiàn), DhHP-6給藥組秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)出現(xiàn)了明顯的DAF-16入核現(xiàn)象, 對(duì)照組并無(wú)明顯入核現(xiàn)象. 表明DHhP-6可促進(jìn)DAF-16入核, 即DhHP-6延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)壽命的作用機(jī)制與DAF-16密切相關(guān).

(A) 對(duì)照組秀麗線蟲(chóng)暗場(chǎng)熒光； (B) 對(duì)照組秀麗線蟲(chóng)明場(chǎng)熒光；(C) DhHP-6給藥組秀麗線蟲(chóng)暗場(chǎng)熒光； (D) DhHP-6給藥組秀麗線蟲(chóng)明場(chǎng)熒光.圖2 DAF-16細(xì)胞核定位Fig.2 DAF-16 nucleic translocation

2.3 DAF-16的轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定 通過(guò)SOD-3與GFP綠色熒光蛋白融合表達(dá)的突變體秀麗線蟲(chóng)CF1553對(duì)SOD-3表達(dá)熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定.sod-3作為daf-16下游基因, 其轉(zhuǎn)錄受DAF-16調(diào)控, 可以用sod-3表達(dá)量作為DAF-16轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)指標(biāo), 確定DhHP-6對(duì)DAF-16轉(zhuǎn)錄活性的影響, 如圖3所示. 由圖3可見(jiàn), DhHP-6給藥組CF1553秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度顯著增高, SOD-3表達(dá)量顯著上調(diào). 表明DhHP-6通過(guò)激活DAF-16入核, 提高了DAF-16轉(zhuǎn)錄活性, 促進(jìn)了DAF-16下游基因sod-3表達(dá), 提高了SOD-3表達(dá)量, 從而引發(fā)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng), 延長(zhǎng)了秀麗線蟲(chóng)壽命.

2.4 秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)ROS的測(cè)定 使用DCF法測(cè)定秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)ROS濃度的變化情況, 結(jié)果如圖4所示. 由圖4可見(jiàn), 秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的ROS隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加； 與對(duì)照組秀麗線蟲(chóng)相比, DhHP-6給藥組秀麗線蟲(chóng)ROS上升幅度明顯減慢； DhHP-6給藥喂食培養(yǎng)6,10,14 d的秀麗線蟲(chóng)與對(duì)照組相比體內(nèi)ROS水平明顯降低. DhHP-6通過(guò)啟動(dòng)DAF-16, 促進(jìn)了SOD-3表達(dá), 有效清除了秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)ROS, 從而延長(zhǎng)了秀麗線蟲(chóng)壽命.

圖3 SOD-3表達(dá)熒光強(qiáng)度測(cè)定Fig.3 Fluorescence measurement of SOD-3 fused with GFP

第一組培養(yǎng)6 d； 第二組培養(yǎng)10 d； 第三組培養(yǎng)14 d.圖4 秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平測(cè)定Fig.4 Measurement of ROS level in vivo of C.elegans

綜上所述, 本文以秀麗線蟲(chóng)為模型生物, 考察了DhHP-6給藥前后對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響及相關(guān)機(jī)制, 并測(cè)定了DAF-16相關(guān)的生理生化指標(biāo). 結(jié)果表明: DhHP-6給藥可延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)壽命, 平均可延長(zhǎng)壽命21%, 該壽命延長(zhǎng)作用機(jī)制與DAF-16因子相關(guān), DhHP-6不影響daf-16缺失型秀麗線蟲(chóng)壽命； DhHP-6可促進(jìn)DAF-16進(jìn)入細(xì)胞核, 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性； DhHP-6給藥可提高DAF-16轉(zhuǎn)錄活性, 促進(jìn)下游基因sod-3表達(dá)量增加； DhHP-6給藥組秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平顯著降低且ROS積累速度減慢.

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