郭玉華，郁有祝

（安陽(yáng)工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程系，河南 安陽(yáng) 455000）

高效液相色譜法測(cè)定茶葉中五種水溶性維生素

郭玉華，郁有祝

（安陽(yáng)工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程系，河南 安陽(yáng) 455000）

用高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫法測(cè)定茶葉中的5種水溶性維生素成分和含量，結(jié)果表明，樣品經(jīng)XDB-C18柱分離，使用紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)266 nm），流動(dòng)相為甲醇與0.03 mol/L KH2PO4（pH＝6.1）混合，梯度洗脫，樣品中5種水溶性維生素得到良好分離，該5種水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.9990以上，平均回收率為84.5%～102.7%，變異系數(shù)RSD<5.4%。測(cè)得普洱茶中VC的含量為14.37 mg/100g，VB1的含量為2.17 mg/100 g，VB6的含量為1.58 mg/100 g，VB2的含量為3.47 mg/100 g，葉酸含量為1.34 mg/100 g；信陽(yáng)毛尖中VC的含量為11.69 mg/100 g，VB6的含量為1.76 mg/100 g，VB2的含量為8.12 mg/100 g，葉酸含量為9.66 mg/100 g，未檢出VB1。

高效液相色譜；水溶性維生素；茶葉

茶葉作為傳統(tǒng)飲料，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、茶多酚、糖類、有機(jī)酸、芳香物質(zhì)、水溶性礦物質(zhì)和多種水溶性維生素。茶葉備受人們的喜歡且長(zhǎng)盛不衰，除了客觀原因以外主要取決于它的自身價(jià)值和一定的藥理作用。茶對(duì)人們的養(yǎng)生、保健、以及疾病防疫等都有一定的功效。

水溶性維生素常用的測(cè)定方法[1]有：紫外分光光度法、熒光法和高效液相色譜法，此外還有毛細(xì)管電泳法[2]。紫外分光光度法干擾比較嚴(yán)重，一般需要經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)那疤幚?，且很難找到一種顯色劑能夠同時(shí)測(cè)定，因此不適于多組分同時(shí)測(cè)定。熒光法測(cè)定維生素的靈敏度高，但線性范圍窄，適合含量較低的維生素測(cè)定。高效液相色譜法因處理樣品簡(jiǎn)單、快速，且能同時(shí)測(cè)定幾種維生素而被廣泛應(yīng)用于食品[3-5]、藥品[6]中維生素的測(cè)定。本論文對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，在優(yōu)化的色譜條件下對(duì)普洱茶和信陽(yáng)毛尖中的5種水溶性維生素含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent l200型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent科技有限公司，配紫外檢測(cè)器；維生素標(biāo)準(zhǔn)品：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度＞98%；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2 維生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取一定量的VC﹑VB1﹑VB6﹑VB2、煙酸，用新配制的0.1 mol/L的鹽酸溶解后定容配成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。葉酸則以少量稀KOH溶解后，再用0.1 mol/L的鹽酸定容配成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前，根據(jù)需要以0.1 mol/L的鹽酸稀釋成指定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品處理

用烘箱將茶葉低溫烘干（溫度不要超過(guò)60℃），然后用研缽研碎，用電子天平準(zhǔn)確稱取一定量的毛尖和普洱茶，用0.1 mol/L的鹽酸浸泡，用超聲清洗器振蕩30 min，再在70℃的恒溫箱中水浴30 min后，取上層清液，加入飽和的醋酸鉛溶液，混勻后靜置，取上層清液過(guò)濾，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；

采用梯度洗脫：流動(dòng)相A為0.03 mol/L KH2PO4（pH＝6.1），B 為甲醇，從進(jìn)樣時(shí) 90%的 A 經(jīng) 10 min線性變化為50%的A；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件

本研究采用甲醇/緩沖溶液體系梯度洗脫[4]，測(cè)試了流動(dòng)相A和B在梯度起始和結(jié)束時(shí)不同組成比例下的洗脫狀況，試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)采用流動(dòng)相體系A(chǔ)為 0.03 mol/L 磷酸二氫鉀（pH＝6.1），B 為甲醇，從進(jìn)樣時(shí)90%的A經(jīng)10 min線性變化為50%的A時(shí)，6種維生素分離情況較好，在12 min內(nèi)出峰完全（見(jiàn)圖1c）。

2.1.2 流動(dòng)相中緩沖液pH對(duì)分離效果的影響

水溶性維生素在水中易產(chǎn)生電離，電離后的離子在反相柱中的保留時(shí)間較短，不利于分離。試驗(yàn)中通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相中KH2PO4溶液的pH來(lái)控制水溶性維生素的電離，從而提高6種維生素在色譜柱上的保留能力，達(dá)到有效分離。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 流動(dòng)相中緩沖液pH對(duì)6種水溶性維生素分離的影響Fig.1 Effect of the pH of the buffer in the mobile phase on separation of the six water-soluble vitamins

由圖1可見(jiàn)，流動(dòng)相中 KH2PO4的pH對(duì)VC、煙酸、VB1之間的分離影響很大，對(duì)其余3種維生素的分離影響不大，并且KH2PO4的pH對(duì)VB1的保留時(shí)間影響很大。當(dāng)pH等于3.5時(shí)，VB1與VC峰部分重疊，VB1保留時(shí)間小于VC的保留時(shí)間，6種維生素的保留時(shí)間順序?yàn)閂B1

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

將6種維生素標(biāo)準(zhǔn)液分別掃描200 nm～350 nm的吸收光譜，試驗(yàn)結(jié)果表明：VC、VB1、VB6、VB2、煙酸、葉酸的最大吸收波長(zhǎng)分別為 266、260、292、266、261、279nm，由于VB1、VB6的保留時(shí)間相差小，難以進(jìn)行波長(zhǎng)切換，又在VB6前后的幾種水溶性維生素的最大吸收波長(zhǎng)均在266 nm附近，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 線性范圍及檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)維生素的一系列濃度，按上述色譜條件每種濃度進(jìn)樣5 μL。分別以各成分的峰面積y對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度X（mg/L）進(jìn)行線性回歸分析，回歸分析結(jié)果、檢出限（信噪比S/N>3）列于表1，結(jié)果表明在表1所列的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度與準(zhǔn)確度

分別取5份云南普洱茶樣品，按上述方法進(jìn)行樣品處理和色譜分離測(cè)定，由它們的結(jié)果計(jì)算方法精密度。本方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～5.4%。采用加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果表明，6種維生素的回收率測(cè)定范圍在84.5%～102.7%。

表1 6種水溶性維生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 1 Regression equation,correlation coefficients,linear ranges and detection limits of six water-soluble vitamins

2.3 樣品測(cè)定

將樣品按上述方法處理后，按最佳色譜條件對(duì)茶葉樣品中的維生素含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。普洱茶和信陽(yáng)毛尖的色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 普洱茶和毛尖茶中水溶性維生素含量Table 2 Content of water-soluble vitamins in Pu Er tea and Mao Jian tea mg/100 g

圖2 茶葉樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the tea samples

3 結(jié)論

采用酸水解法處理樣品、流動(dòng)相梯度洗脫，可簡(jiǎn)單、快速地測(cè)定茶葉中的5種水溶性VC、VB1、VB2、VB6和葉酸。結(jié)果表明：使用該方法檢測(cè)，平均回收率為84.5%～102.7%，變異系數(shù)RSD<5.4%，準(zhǔn)確度和精密度均能滿足定量分析的要求，對(duì)食品、水果蔬菜中水溶性維生素的測(cè)定有一定的參考價(jià)值。

[1]Maria Cortes S M,Montana C H,Carmen D M.Comparison of highperformance liquid chromatography and spectrofluorimetry for vitamin C analysis of green beans[J].Eur Food Res Technol,2000,210:220-225

[2]鄧光輝,李濟(jì)權(quán),馬少妹.高效毛細(xì)血管電泳電導(dǎo)法快速檢測(cè)復(fù)方維生素片中的、VB12、VB6和VC[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2003,22(4):53-55

[3]成志強(qiáng),孫成均,黎源倩.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品和多維片中8種水溶性維生素[J].分析化學(xué),2001,29(9):1068-1071

[4]黃紅霞.HPLC法測(cè)定蘑菇粉等中水溶性維生素的含量[J].海峽藥學(xué),1999,11(4):33-35

[5]賀利民,呂岱竹,蘇貽娟.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定多種水溶性維生素[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,22(1):54-56

[6]申燁華,張萍,孔祥虹,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定扁桃仁中的水溶性維生素C,B1,B2,B6[J].色譜,2005,23(5):538-541

Determination of Five Water-Soluble Vitamins in Tea by High Performance Liquid Chromatography

GUO Yu-hua,YU You-zhu
(Department of Chemistry and Environmental Engineering,Anyang Institute of Technology,Anyang 455000,Henan,China)

A HPLC gradient elution method with UV detector was established to determine five Water-Soluble Vitamins in the tea.The optimized conditions as follows:XDB-C18column with methanol and 0.03 mol/L KH2PO4buffer (pH=6.1)as mobile phase,and gradient elution,detector wavelength was 266 nm.The correlation coefficients were more than 0.9990.The recoveries were 84.5%-102.7%,RSD<5.4%.For vitamins C,B1,B2,B6and Folic Acid,the contents were found to be 14.37 mg/100 g,2.17 mg/100 g,3.47 mg/100 g,1.58 mg/100 g and 1.34 mg/100 g in Puer tea;for Maojian tea,the contents of vitamins C,B2,B6and Folic Acid were 11.69 mg/100 g,8.12 mg/100 g,1.76m g/100 g,9.66 mg/100 g,respectively.While vitamin B1was not discovered in Maojian tea.

high performance liquid chromatography;water-soluble vitamins;tea

郭玉華（1979—），女（漢），講師，碩士，主要從事藥物分析化學(xué)研究。

2011-12-10