鄒險(xiǎn)峰 ，吳修利 ，陳星 ，高長城 ，*

（1.長春大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130022；2.長春大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

大豆球蛋白的水解研究

鄒險(xiǎn)峰1，吳修利2，陳星1，高長城1，*

（1.長春大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130022；2.長春大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

采用Nagano法從豆粕中分離大豆球蛋白，利用大豆蛋白改性酶解大豆球蛋白制備水解肽，以單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定酶解最佳條件，通過高效液相法分析大豆球蛋白水解肽的分子量分布。結(jié)果顯示：在20 g/L的底物濃度下的最佳條件為酶和底物比10000 U/g，溫度55℃，pH8.0，水解時(shí)間4 h。優(yōu)組合條件下的水解度為69.6%。大豆球蛋白水解肽主要為130 u～1000 u的短肽，占肽總量的86.5%，說明大豆球蛋白水解肽的均一性極高。

大豆球蛋白；大豆球蛋白水解肽；大豆蛋白改性酶

中國是大豆的故鄉(xiāng)，大豆不僅提供了豐富的大豆植物油，而且也是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源。大豆蛋白質(zhì)含量高達(dá)干重的40%，其中80%～88%為水溶性蛋白質(zhì)，而球蛋白占水溶性蛋白質(zhì)的94%，球蛋白主要由大豆球蛋白(glycinin)和 β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)組成，分別占大豆蛋白質(zhì)總量的50%和33%。大豆蛋白質(zhì)含有全部人體的8種必需氨基酸，且比例合理，賴氨酸含量可以與動(dòng)物蛋白相媲美，是食品加工業(yè)的重要原料。研究表明，大豆蛋白水解肽具有更好的生物活性和營養(yǎng)價(jià)值，因此，對大豆蛋白質(zhì)的利用已經(jīng)進(jìn)入肽階段。目前大豆肽的生產(chǎn)方法主要有酶解法和微生物發(fā)酵法，其中以酶解法最為常用。酶解用酶主要包括動(dòng)物蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶如木瓜蛋白酶菠蘿蛋白酶等；微生物蛋白酶如堿性蛋白酶、中性蛋白酶等。目前市售大豆肽均為大豆蛋白水解獲得，但由于大豆蛋白為混合蛋白質(zhì)，得到的大豆肽成分繁雜，均一性較差。本研究采用先將大豆蛋白質(zhì)分離純化的方法得到大豆球蛋白，采用了大豆蛋白改性酶作為水解酶，通過酶解大豆球蛋白制備大豆肽，對水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對水解肽的分子量分布進(jìn)行分析，為大豆肽的生產(chǎn)提供了新的酶類，也為工業(yè)生產(chǎn)高品質(zhì)的大豆肽提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

脫脂豆粕：吉林省通榆蛋白質(zhì)廠；大豆蛋白改性酶：南寧龐博生物工程有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Holotransferrin，77000u；Apomyoglobin，16951u；Ribonuclease A，13700 u；Cytochrome C，12400 u）、肽分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Gly-Tyr，239.2 u；Val-Tyr-Val，379.5 u；Leu-enkephal in，569.7u；Met-ekephalin，573.7u；Angiotensin Ⅱ，1296u）：美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-2100型冷凍干燥儀：日本EYELA公司；J-26XP型高速冷凍離心機(jī)：美國BECKMAN COULTER公司；AlphaImager HP型凝膠成像系統(tǒng)：美國Alpha公司；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆球蛋白的分離和表征

大豆球蛋白的分離采用優(yōu)化的Nagano法[1]，表征采用SDS-PAGE還原電泳。

1.3.2 指標(biāo)測定

蛋白酶活力測定采用福林法[2]；蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法[3]；水解度(the Degree of Hydrolysis,DH)的測定采用三氯乙酸(TCA)法[4]。

1.3.3 酶解工藝路線和酶解條件優(yōu)化

1.3.3.1 酶解工藝路線

大豆球蛋白→調(diào)漿→酶解→滅酶→酸沉→離心→上清液冷凍干燥

1.3.3.2 單因素試驗(yàn)

以DH為指標(biāo)研究不同的底物濃度、酶與底物比、水解時(shí)間、pH和溫度對大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白的影響。

1.3.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶與底物比、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH作為考察因素，采用正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以DH為考察指標(biāo)，利用數(shù)據(jù)DPS3.01處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析，篩選大豆球蛋白的最佳酶解條件，并對最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3.4 大豆球蛋白水解肽的分子量分布

大豆球蛋白水解肽的分子量測定采用高效液相法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆球蛋白的表征

通過Nagano法分離得到大豆球蛋白，分離效果用SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，大豆球蛋白中混有少量的β-伴大豆球蛋白。通過AlphaInnotech-AlphaView軟件的光密度掃描分析得出大豆球蛋白含量為86.6%。

圖1 大豆球蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE of the glycinin

2.2 大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白的單因素試驗(yàn)

2.2.1 底物濃度對水解的影響

水解條件：酶和底物比8000 U/g，溫度50℃，pH 7.5，水解時(shí)間 4 h。以 DH 為指標(biāo)研究 10、20、30、40、50 g/L的底物濃度對水解的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 底物濃度對水解度的影響Fig.2 Effects of substrated concentration on DH of hydrolysate

大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白在水溶液中進(jìn)行，大豆球蛋白可溶解于水，由圖2可以看出，底物濃度對水解度的影響很大，在10 g/L～50 g/L的底物濃度范圍內(nèi)，大豆球蛋白的水解度均隨著底物濃度的增加而顯著下降。雖然10 g/L的底物濃度下水解度最大，但在實(shí)際生產(chǎn)主要考慮生產(chǎn)效率，因此選擇20 g/L的蛋白濃度。

2.2.2 酶與底物比對水解的影響

水解條件：底物濃度20g/L，溫度50℃，pH7.5，水解時(shí)間 4h。以 DH 為指標(biāo)研究 4000、6000、8000、10000、12000 U/g的酶與底物比對水解的影響。結(jié)果見圖3。在工業(yè)生產(chǎn)中，酶濃度是影響成本的重要因素。由圖3可以看出，在底物濃度一定時(shí)，水解度與酶濃度呈正相關(guān)，當(dāng)酶與底物比達(dá)到8000 U/g時(shí)，大豆球蛋白水解度基本達(dá)到最大，繼續(xù)增加酶與底物比水解度也不再增加。因此，可以選擇的酶與底物比對為8000 U/g。

圖3 酶與底物比對水解度的影響Fig.3 Effects of enzyme concentration on DH of hydrolysate

2.2.3 水解時(shí)間對水解的影響

水解條件：底物濃度20 g/L，酶和底物比8000 U/g，溫度 50℃，pH 7.5。以 DH為指標(biāo)研究2、3、4、5、6 h的水解時(shí)間對水解的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 水解時(shí)間對水解度的影響Fig.4 Effects of time on DH of hydrolysate

水解時(shí)間是影響酶解反應(yīng)的重要因素，對工業(yè)生產(chǎn)效率也有直接的影響。由圖4可以看出，水解度與酶解時(shí)間呈正相關(guān)。大豆球蛋白的水解度在4 h左右達(dá)到最大值。因此，選擇4 h的水解時(shí)間。

2.2.4 pH對水解的影響

水解條件：底物濃度20 g/L，酶和底物比8000 U/g，溫度50℃，水解時(shí)間4 h。以DH為指標(biāo)研究7.0、7.5、8.0、8.5的pH對水解的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH對水解度的影響Fig.5 Effects of pH on DH of hydrolysate

pH是影響酶催化活性的重要因素。由圖5可以看出，大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白的最適pH為8.0。

2.2.5 水解溫度對水解的影響

水解條件：底物濃度20 g/L，酶和底物比8000 U/g，pH 7.5，水解時(shí)間4 h。以DH為指標(biāo)研究40、45、50、55、60℃的水解溫度對水解的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 水解溫度對水解度的影響Fig.6 Effects of temperature on DH of hydrolysate

水解溫度對大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白有雙重影響。一方面溫度增加會(huì)降低溶液的黏度，提高蛋白質(zhì)的分散性，有利于酶與底物的結(jié)合，提高水解度；另一方面，過高的溫度會(huì)加速酶的變性導(dǎo)致水解度降低。由圖6可以看出，在低溫條件下，蛋白水解度較低，隨著溫度的增加，蛋白水解度逐漸增大，在55℃左右達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白水解度的下降。因此，大豆球蛋白的最適溫度為55℃。

2.3 酶解反應(yīng)的正交試驗(yàn)

根據(jù)以上的單因素試驗(yàn)，初步認(rèn)定大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白反應(yīng)的適宜條件為：酶和底物比8000U/g，溫度55℃，pH8.0，水解時(shí)間4h。選取了 20g/L的底物濃度作為試驗(yàn)濃度。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對酶和底物比、水解時(shí)間、溫度和pH 4種因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素、水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

由極差分析可知，各因素對水解度的影響大小順序?yàn)锳>D>C>B，即酶和底物比>溫度>pH>水解時(shí)間根據(jù)K值大小得到酶解反應(yīng)條件的優(yōu)組合為A3B2C2D2，即酶和底物比 10000 U/g，溫度 55 ℃，pH8.0，水解時(shí)間4 h。優(yōu)組合條件下的水解度為69.6%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.4 大豆球蛋白水解肽的分子量分布

對大豆球蛋白水解肽進(jìn)行高效分子排阻色譜分析，洗脫圖譜見圖7，通過GPC軟件計(jì)算后分子量分布情況見表3。

圖7 大豆球蛋白水解肽的高效分子排阻色譜分析Fig.7 HPLC(TSKgel G2000swxl,300 mm×7.8 mm)of glycinin peptide.Flow phase:acetonitrile/water/TFA=10/90/0.1(v/v/v);Wavelength:220 nm;Flow rate:0.5 mL/min;Injection volume:20 μL;Temperature:25℃.

由表3可以看出，大豆球蛋白水解肽的分子量主要分布在130 u～1000 u之間，占肽總量的86.5%。其中300 u～1000 u為2個(gè)～8個(gè)氨基酸殘基的短肽，這部分占肽總量的64.7%；130 u～300 u占21.8%，根據(jù)數(shù)均分子量和重均分子量分析，其主要成分為二肽；還有10%的分子量為1000 u～5000 u的寡肽及少量的氨基酸，小于130 u的部分主要為單氨基酸，由于分子量處在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，所以分子量的數(shù)值偏低。說明了大豆蛋白改性酶對大豆球蛋白的水解充分，水解產(chǎn)物具有良好的均一性，單氨基酸的含量很低，有利于產(chǎn)物的分離純化和性質(zhì)鑒定，并且對于發(fā)揮大豆肽的功能性具有重要意義。

表3 大豆球蛋白水解肽的分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of glycinin peptide peptides

3 結(jié)論

采用大豆蛋白改性酶水解大豆球蛋白，結(jié)果表明，在20 g/L的蛋白濃度下最佳的酶解條件為酶和底物比10000 U/g，溫度55℃，pH8.0，水解時(shí)間4 h。優(yōu)組合條件下的水解度為69.6%。高效分子排阻色譜分析表明大豆球蛋白水解肽主要為130 u～1000 u的短肽，占肽總量的86.5%，表現(xiàn)出良好的均一性。大豆球蛋白水解肽的生理功能需要進(jìn)一步研究。本研究為工業(yè)生產(chǎn)大豆肽提供了理論依據(jù)。

[1]劉春,王紅玲,崔竹梅，等.大豆籽粒貯藏蛋白11S和7S組分提取分離方法的優(yōu)化[J].中國油脂,2006,31(2):31-36

[2]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 23527-2009蛋白酶制劑[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009：6-8

[3]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010:1-4

[4]肖凱軍,高孔榮,曾慶孝.酶解大豆分離蛋白的特性研究[J].廣州食品工業(yè)科技,1995,11(2):5-10

[5]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 22492-2008大豆肽粉[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008：4-5

Study on Hydrolysis of Glycinin

ZOU Xian-feng1,WU Xiu-li2,CHEN Xing1,GAO Chang-cheng1,*
（1.Key Laboratory of Agricultural Products Processing in Changchun University,Changchun 130022,Jilin，China；2.College of Biological Sci&Tech，Changchun University,Changchun 130022,Jilin，China）

According to Nagano method,glycin in was isolated from soybean cake and was hydrolyzed by soy protein modification enzyme to produce hydrolysate peptide.Optimum enzymatic hydrolysis conditions were determined by single-factor and orthogonal test.Then the distribution of glycinin hydrolysate peptide was detected by means of HPLC.Results showed that these optimum conditions were followed:10000 U/g of enzyme concentration,55℃,pH 8.0 and 4 h of reaction time when substrate concentration was 20 g/L,and the degree of hydrolysis(DH)was 69.6%in these conditions.Glycinin hydrolysate peptides of 130 u-1000 u occupied 86.5%in total peptides,which showed that the peptide possessed excellent uniformity.

glycinin;glycinin hydrolysate peptide;soy protein modification enzyme

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2008365)；吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2009229)；長春市科技計(jì)劃項(xiàng)目(08YJ18)

鄒險(xiǎn)峰（1971—），男（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者

2011-07-29