郭又嘉，文 坎，張士軍，吳 咖，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間病理階段，慢性肝病大多數(shù)都有肝纖維化，其中25%～40%最終發(fā)展成肝硬化甚至肝癌［1］。玉郎傘(YLS)為豆科植物疏葉崖豆［Millettia Pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei］的干燥根，始見(jiàn)于《廣西中藥志》，為廣西壯、瑤醫(yī)常用藥材。迄今國(guó)內(nèi)外只有本課題組對(duì)其進(jìn)行提取分離及相關(guān)藥理、藥效研究［2］。而玉郎傘皂苷(YLSS)為YLS的一個(gè)分離部位，前期研究表明其具有抗自由基、抗高血壓、保護(hù)離體心血管、保護(hù)大腦缺血/再灌注損傷等作用［3－5］，但尚未見(jiàn)其抗肝纖維化的報(bào)道。而自由基可使肝星狀細(xì)胞激活，促進(jìn)Ⅰ型膠原合成，引發(fā)肝臟的纖維化反應(yīng)［6］，本文以YLSS為研究對(duì)象，探討其對(duì)HF的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g，♀♂各55只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SCXK桂2009-0002。

1.2 藥物及試劑 四氯化碳(AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100925)、食用油(嘉里糧油有限公司，SB/T 10292)、玉郎傘皂苷(簡(jiǎn)稱(chēng)YLSS，由本實(shí)驗(yàn)室自行提取，提取率為1.49%)、秋水仙堿片(西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)110403);試劑盒:分別為AST(批號(hào)20110312)、ALT(批號(hào)20110317)、考馬 斯 亮 藍(lán) (批 號(hào) 20110321)、SOD(批 號(hào)20110728)、MDA(批號(hào) 20110716)、GSH(批號(hào)20110816)和GSH-Px(批號(hào)20110816)試劑盒，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有:TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、CL17R低溫高速離心機(jī)(北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司)。

2 方法

2.1 CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的建立 將♀♂SD大鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境5 d后分別隨機(jī)分成兩組:肝纖維化模型組及正常對(duì)照組。肝纖維化模型組♀♂大鼠分別為♀50只、♂44只，均以50%CCl4食用油溶液1 ml·kg－1灌胃，每周稱(chēng)重并灌胃2次，按實(shí)際體重調(diào)整給藥劑量［7］;正常對(duì)照組♀♂大鼠均為10只，共20只給予NS灌胃，劑量及給藥方法同肝纖維化模型組。造模第7、8周，將♂大鼠麻醉，固定，于腋前線第8肋間進(jìn)針，刺入肝臟0.5～0.8 cm，拔出穿刺針，取出肝組織條置10%甲醛固定［8］;第9、10周對(duì)♀大鼠進(jìn)行肝臟穿刺，操作同上。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及用藥［9］將確認(rèn)形成肝纖維化的大鼠隨機(jī)分為5組:給藥組共4組，每組♀♂各8只;模型對(duì)照組1組，♀♂各10只;加上空白對(duì)照組♀♂各10只，共6組。陽(yáng)性組給予秋水仙堿0.2 mg·kg－1;YLSS 高、中、低劑量組(YLSSH、YLSSM、YLSSL)分別給予 YLSS 80、40、20 mg·kg－1;空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予NS 10 ml·kg－1。各組動(dòng)物在相同條件下飼養(yǎng)，均以每日1次、空腹灌胃，連續(xù)給藥4周。除空白對(duì)照組外，其余各組均繼續(xù)給予50%CCl4油溶液(同造模方法)。

2.3 樣本制備 末次給藥禁食不禁水24 h后，腹腔注射戊巴比妥納30 mg·kg－1麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4℃離心分離血清，－20℃保存，用于 ALT、AST的測(cè)定。取肝組織做10%勻漿后于－80℃冰箱保存，用于 SOD、MDA、GSH、GSH-Px及考馬斯亮藍(lán)的測(cè)定;于肝左葉同一部位取肝組織約(1×1×1)cm3大小，固定于10%甲醛溶液，做光鏡觀察。

2.4 指標(biāo)測(cè)定 血清中ALT(賴(lài)氏法)、AST(賴(lài)氏法)和肝組織總蛋白含量、GSH、GSH-Px、SOD、MDA的檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 肝組織病理學(xué)檢查 各組大鼠肝臟標(biāo)本以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，經(jīng)石蠟包埋后切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織纖維化程度。

2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)的計(jì)算采用Excel表格法。而標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，則以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析:計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析法處理(經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊者采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較);計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)。

Tab 1 Effect of YLSS on the activity of ASTand ALT in the serum of rats(±s)

Tab 1 Effect of YLSS on the activity of ASTand ALT in the serum of rats(±s)

＊＊P ＜0.01 vs model control group;ΔΔP ＜0.01 vs normal control group

Group n AST/IU·L－1 ALT/IU·L －1 YLSSL 14 148.90 ±12.11ΔΔ＊＊ 49.85 ±3.31＊＊YLSSM 14 129.93 ±4.72ΔΔ＊＊ 46.38 ±14.20＊＊YLSSH 15 117.65 ±11.19＊＊ 41.37 ±7.10＊＊Colchicine 15 139.62 ±34.18＊＊ 53.14 ±15.07＊＊Model control 16 361.95 ±61.57ΔΔ 105.78 ±59.18ΔΔ Normal control 20 109.86 ±9.69＊＊ 38.96 ±5.95＊＊

3 結(jié)果

3.1 YLSS對(duì)肝纖維化大鼠血清AST、ALT的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清AST與ALT的含量升高(P＜0.01)，YLSS低、中劑量組AST含量亦與空白組差別有顯著性(P＜0.01)。而與模型組比較，YLSS各劑量組和陽(yáng)性組大鼠血清AST和ALT含量均降低(P＜0.01)。見(jiàn)Tab 1。

3.2 YLSS對(duì)肝纖維化大鼠肝組織SOD、MDA、GSH、GSH-Px的影響 與空白組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px及GSH明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01);而YLSS中、高劑量組的GSH-Px增高(P＜0.01)。與模型組比較，YLSS各劑量組與陽(yáng)性組均可升高肝纖維化大鼠血清SOD及GSH活力(P＜0.01或P＜0.05)，降低肝纖維化大鼠肝組織MDA含量(P＜0.01);YLSS各劑量組肝組織中GSH-Px活力升高(P＜0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組GSH-Px活力與模型對(duì)照組及空白對(duì)照組比較差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而隨著給藥劑量的增高，YLSS提升SOD能力逐漸升高，但降低MDA的能力有所降低(Tab 2)。

Tab 2Effects of YLSS on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，GSH in the liver tissue(±s)

Tab 2Effects of YLSS on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，GSH in the liver tissue(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model control group;ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01 vs normal control group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro GSH-Px/μmol·g－1Pro GSH/μmol·g－1Pro YLSSL 14 131.72 ±31.76* 1.16 ±0.29Δ＊＊ 750.87 ±41.37＊＊ 4.95 ±0.27ΔΔ*YLSSM 14 138.36 ±22.08＊＊ 1.43 ±0.50＊＊ 851.80 ±89.37ΔΔ＊＊ 5.30 ±0.42ΔΔ＊＊YLSSH 15 153.73 ±27.31＊＊ 1.47 ±0.40＊＊ 862.91 ±100.10ΔΔ＊＊ 5.83 ±0.65＊＊Colchicine 15 126.64 ±18.88＊＊ 2.00 ±0.41＊＊ 515.65 ±312.03 5.71 ±0.89＊＊MC 16 92.70 ±16.07ΔΔ 3.65 ±0.89ΔΔ 374.12 ±291.96ΔΔ 4.32 ±0.53ΔΔ NC 20 167.55 ±51.82＊＊ 2.04 ±0.78＊＊ 683.37 ±196.29＊＊ 6.58 ±0.44＊＊

3.3 YLSS對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理組織學(xué)觀察 正常對(duì)照組:大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，為類(lèi)圓形，肝細(xì)胞排列整齊，表現(xiàn)為肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，未見(jiàn)變性和壞死;中央靜脈及肝竇未見(jiàn)充血、出血和水腫;匯管區(qū)亦未見(jiàn)纖維組織增生。模型對(duì)照組:肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)纖維組織明顯增生并伸入小葉將肝小葉分割，形成假小葉，結(jié)節(jié)周?chē)w維組織增生，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。YLSSH組:肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝組織匯管區(qū)及小葉內(nèi)散在點(diǎn)狀、星芒狀纖維組織增生，纖維間隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)大部分保存，并伴濁腫變性、脂肪變性。YLSSM及陽(yáng)性對(duì)照組:纖維組織增生，纖維間隔形成，局部可見(jiàn)分隔并破壞肝小葉，大部分肝小葉結(jié)構(gòu)保留，但排列紊亂，而無(wú)肝硬化改變。YLSSL組:大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，致小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但尚未形成假小葉。

纖維化程度按2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)，肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中標(biāo)準(zhǔn)分期，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性組及YLSS高、中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而YLSS低劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(Tab 3，F(xiàn)ig 1 ～6)。

Tab 3 Effect of YLSS on pathological grade of liver in each group

Fig 1 Hepatic lobule of YLSSLgroup Fig 2 Hepatic lobule of YLSSMgroup Fig 3 Hepatic lobule of YLSSHgroup Fig 4 Hepatic lobule of colchine group Fig 5 Hepatic lobule of model control group Fig 6 Hepatic lobule of nomal control group

4 討論

HF是慢性非自限性肝損傷的后果，存在于幾乎所有類(lèi)型的慢性肝損傷疾病中［10］?，F(xiàn)大多學(xué)者認(rèn)為，肝纖維化的主要機(jī)制是在肝臟持續(xù)損傷過(guò)程中，一些細(xì)胞分泌諸多細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子使肝星狀細(xì)胞(hepatic stelate cels，HSC)活化并轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(MFB)，MFB分泌大量膠原并合成細(xì)胞外基質(zhì)(extra celular matrix，ECM)，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生［11］?，F(xiàn)已公認(rèn)，HF 是可逆性的病變之一［12－14］，若進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化則難以逆轉(zhuǎn)。

CCl4為目前最為常用的誘導(dǎo)肝損傷的藥物，采取反復(fù)多次給藥的方法可制備慢性肝損傷模型。肝損傷主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞反復(fù)的破壞、再生、肝組織結(jié)構(gòu)改變、肝纖維化和肝硬化的發(fā)生［15］。CCl4可經(jīng)肝細(xì)胞的細(xì)胞色素P450 Fe2+作用產(chǎn)生超氧陰離子()，并通過(guò)自由基反應(yīng)擴(kuò)展程序產(chǎn)生三氯甲基自由基(CCl3·)、二氯甲基自由基(CCl2·)和過(guò)氧化甲基自由基(CClOO·)等自由基。可轉(zhuǎn)化為

3H2O2，后者又經(jīng)鐵離子(Fe3+)促發(fā)Fenton反應(yīng)生成羥自由基(OH·)。OH·、CCl2·和CCl3OO·等自由基可攻擊膜磷脂中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發(fā)膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)［16］，最終導(dǎo)致MDA形成增多，肝細(xì)胞膜通透性增加，ALT與AST大量釋放入血。鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物質(zhì)可引起炎癥反應(yīng)、刺激庫(kù)普弗細(xì)胞(kuffer cells)活化，進(jìn)而促進(jìn)HSC細(xì)胞的活化增殖，導(dǎo)致肝纖維化［17］;另外，CCl3·還可抑制鈣泵［18］，使Ca2+大量滯留于細(xì)胞內(nèi)，以致肝細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為，YLSS各劑量組可降低肝纖維化大鼠血清ALT、AST水平和肝組織中MDA含量，提高肝組織中SOD、GSH-Px和GSH活性。該結(jié)果提示了YLSS作用機(jī)制可能為通過(guò)提高 S OD、GSH-Px和GSH含量，增強(qiáng)清除氧自由基能力，抑制肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、減輕細(xì)胞損傷;而GSH的含量的增高，可能與其提高GSH-Px有關(guān)。可見(jiàn)，YLSS可有效地緩解CCl4所致的大鼠肝細(xì)胞損傷，并對(duì)大鼠肝纖維化具有較好的逆轉(zhuǎn)作用。

同時(shí)，由上文的敘述可知MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)YLSS對(duì)體內(nèi)MDA的影響發(fā)現(xiàn)，隨著給藥濃度的增加MDA含量略有增高，但總體較模型組低。MDA不與劑量呈正相關(guān)可能原因有以下方面。一方面，體內(nèi)的抗氧化有酶系和非酶系統(tǒng)，SOD、GSH-Px及GSH為酶系，而MDA為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，也許不呈正相關(guān)與其對(duì)抗氧化非酶系統(tǒng)的作用有關(guān);第2方面，本課題組在“玉郎傘多糖和皂苷對(duì)氧自由基清除作用研究”中發(fā)現(xiàn)，玉郎傘皂苷在體外并非對(duì)所有自由基的生成有抑制及清除作用，其對(duì)具有明顯的抑制及清除作用，但對(duì)OH·則是促進(jìn)生成的作用［19］;第3方面，自由基在機(jī)體正常生理過(guò)程中是存在的，機(jī)體是個(gè)整體，也許體內(nèi)自由基的生成和消除體系存在一個(gè)負(fù)反饋的過(guò)程，使之趨于平衡。

綜上所述，YLSS對(duì)CCl4所致的大鼠肝纖維化具有一定的抑制作用，機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)，同時(shí)其體內(nèi)過(guò)程可能存在更為復(fù)雜的交互作用。

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