王國峰，趙 霞，李 寧，陳冬梅

(1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院干部病房三科，山東 濟(jì)南 250031;2.中國科學(xué)院生物物理研究所腦與認(rèn)知科學(xué)中心，北京 100101)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多因素誘導(dǎo)的慢性炎性疾病，內(nèi)皮細(xì)胞功能異常為其始動(dòng)環(huán)節(jié)［1－4］。脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)可與內(nèi)皮細(xì)胞 TLR4(Toll-like receptor 4)受體結(jié)合，激活MAPK、JAK/STAT等信號(hào)通路，促使NF-κB入核，導(dǎo)致炎癥和黏附分子表達(dá)［5］，LPS在 AS整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程中都起著非常重要的作用［6］?；ㄉ南┧?arachidonicacid，AA)通路在內(nèi)皮細(xì)胞活化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及內(nèi)膜增殖中發(fā)揮重要作用。其中限速酶——環(huán)氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和 5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)，可催化炎癥因子PGE2及白三烯類(leukotriene，LTs)生成，在泡沫細(xì)胞中大量表達(dá)［7］。5-LOX結(jié)合蛋白(5-lipoxygenase activating protein，F(xiàn)LAP)是定位于核膜上的膜結(jié)合蛋白，介導(dǎo)LOX錨定到核膜上，F(xiàn)LAP基因突變與心梗危險(xiǎn)性密切相關(guān)，F(xiàn)LAP抑制劑MK-886可減輕載脂蛋白E和低密度脂蛋白受體雙敲除小鼠AS斑塊形成［8］。

川芎嗪(ligustrazine，LIG)是川芎的主要活性成分，廣泛應(yīng)用于治療心絞痛和腦缺血［9］。近年有報(bào)道LIG保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，提高機(jī)體NO水平等［10］，但對于內(nèi)皮細(xì)胞上其他受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究均無涉及。

本文從內(nèi)皮損傷這一始動(dòng)環(huán)節(jié)入手，以LPS誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型，觀察LIG對AA通路炎癥反應(yīng)的影響;進(jìn)一步研究對其偶聯(lián)的MAPK和STAT通路的影響。為深入理解LIG抗AS機(jī)制，拓展其臨床適應(yīng)癥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞系CC-2585(批號(hào)1F2025)及培養(yǎng)基EGM-2(含胎牛血清及7種生長因子如 hydrocortisone、hFGF-B、EGF、R3-IGF-1、ascorbic acid、hEGF、GA-1000)購于畢龍公司。

1.2 藥品與試劑 鹽酸LIG(純度98.5%):中國藥品與生物制品檢定所。I型膠原酶、胰蛋白酶:Sigma公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基、新牛血清:Gibco公司產(chǎn)品;LPS:Sigma公司產(chǎn)品;COX-2、5-LOX、FLAP、p-p38MAPK和 p-STAT3抗體購自 Santa Cruz Biotechnology Inc;SuperSignal West Pico chemiluminescent substrate購自 Pierce(Rockford，IL)。其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) T25培養(yǎng)瓶用2%明膠包被，4℃過夜，將CC-2585人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞從液氮中取出后37℃水浴3 min使之解凍后均勻分到培養(yǎng)瓶中，加入人的培養(yǎng)基EGM-2后37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h細(xì)胞貼壁后第1次換液。以后按常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞長至融合，按1∶2進(jìn)行傳代。

1.4 LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將細(xì)胞以2 ×108·L－1接種于6 孔板，每孔1.5 ml，細(xì)胞總數(shù)為3×105個(gè)/孔，待細(xì)胞穩(wěn)定24 h后，用無血清EGM-2培養(yǎng)基預(yù)處理(pH 7.2)，LIG以EGM-2培養(yǎng)基配置成濃度為1 mmol·L－1的濃縮液。內(nèi)皮細(xì)胞分組如下:①正常對照組(培養(yǎng)基中為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液);②LPS組(培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mg·L－1的 LPS孵育2 h);③ LPS+LIG 組:在給予 LPS前，以LIG(1 和10 μmol·L－1)預(yù)處理細(xì)胞6 h;④ LPS+LIG+p-p38MAPK抑制劑SB203580或JAK2抑制劑AG490組:在給予LPS前，以LIG(10 μmol·L－1)和 p-p38MAPK 抑制劑 SB203580(20 μmol·L－1)或 p-STAT3抑制劑 AG490(30 μmol·L－1)同時(shí)預(yù)處理細(xì)胞6 h。

1.5 Western blot RIPA裂解液 (Tris-HCl 50 mmol·L－1，pH 7.4 NaCl 150 mmol·L－1，EDTA 1 mmol· L－1，Na-deoxycholate 0.25%，NP-40 1%，PMSF 1 mmol·L－1，Na3VO41 mmol·L－1，NaF 1 mmol·L－1，Aprotinin 10 mg·L－1，leupeptin 5 mg·L－1，pepstatin 5 mg·L－1)重懸 5×106cells，冰上裂解45 min。裂解液14 000×g離心15 min。Lowry法測定上清中的蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS/PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，然后一抗4℃孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min，然后與二抗孵育1 h。TBST洗3遍后顯影。

2 結(jié)果

2.1 對COX-2蛋白表達(dá)的影響 LIG對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響如Fig 1所示，LPS可誘導(dǎo)COX-2蛋白表達(dá)水平增高，LIG 1和10 μmol·L－1，可使其蛋白水平分別降低為模型組0.21倍和0.25倍(P＜0.01);p-p38MAPK抑制劑SB203580則可使其蛋白水平增高為LIG(10 μmol·L－1)組的4.17倍(P＜0.01)。

2.2 對5-LOX蛋白表達(dá)的影響 LIG對LPS損傷內(nèi)皮細(xì)胞后5-LOX蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示。LPS可誘導(dǎo)5-LOX蛋白表達(dá)水平增高，LIG 1和10 μmol·L－1，可使其蛋白水平分別降低為模型組的0.20倍和0.37倍(P＜0.01);SB203580則可使其蛋白水平增高為 LIG(10 μmol·L－1)組的1.16倍(P＜0.01)。

2.3 對FLAP蛋白表達(dá)的影響 LIG對LPS損傷內(nèi)皮細(xì)胞FLAP蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示。LPS可誘導(dǎo) FLAP蛋白表達(dá)水平增高，LIG 10 μmol·L－1，可使其蛋白水平降低為模型組的0.42倍(P＜0.01)，1 μmol·L－1低劑量組對 FLAP 蛋白表達(dá)無影響(P＞0.01);SB203580則可使其蛋白水平增高為 LIG(10 μmol·L－1)組的2.89 倍(P＜0.01)。

2.4 對MAPK通路磷酸化激活的影響 LPS可誘導(dǎo)MAPK通路中p38MAPK磷酸化水平升高而激活，LIG 1 和 10 μmol·L－1，可使其磷酸化水平分別降低為模型組的0.50倍和0.07倍(P＜0.01);SB203580則使其磷酸化水平增高為LIG(10 μmol·L－1)組的17.80倍(P＜0.01，F(xiàn)ig 4)。

Fig 1 Effect of ligustrazine on the protein expression of COX-2 in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

Fig 2 Effect of ligustrazine on the protein expression of 5-LOX in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

2.5 對JAK2/STAT3通路磷酸化激活的影響LPS可誘導(dǎo)JAK2/STAT3通路中STAT3蛋白磷酸化水平升高而激活，LIG 1 和 10 μmol·L－1可使其磷酸化水平分別降低為模型組的0.48倍和0.28倍(P＜0.01);JAK2特異性抑制劑AG490則使其磷酸化水平增高為LIG(10 μmol·L－1)組的4.55倍(P＜0.01，F(xiàn)ig 5)。

Fig 3 Effect of ligustrazine on the protein expression of FLAP in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

1:Control;2:LPS;3:LPS+LIG(1 μmol·L－1);4:LPS+LIG(10 μmol·L－1);5:LPS+LIG(10 μmol·L－1)+SB203580.＊＊P＜0.01vscontrol;##P＜0.01vsLPS;△△P＜0.01vsLPS+LIG

Fig 4 Effect of ligustrazine on the protein expression of p-p38MAPK in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

3 討論

3.1 抑制花生四烯酸炎癥通路，改善內(nèi)皮功能為其抗AS關(guān)鍵環(huán)節(jié) 目前關(guān)于LPS在AS形成中對AA通路炎癥反應(yīng)及其信號(hào)通路的研究尚不夠系統(tǒng)和深入，尚無靶向內(nèi)皮細(xì)胞，抑制該通路及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的安全有效、毒副作用低的臨床藥物應(yīng)用。但國內(nèi)外已有研究表明，AA代謝的限速酶COX-2、5-LOX及結(jié)合蛋白FLAP在AS發(fā)生發(fā)展的不同階段均發(fā)揮重要作用［11］。免疫組織化學(xué)研究也表明:5-LOX、FLAP及LTA4水解酶等在AS斑塊區(qū)表達(dá)明顯增加，并與內(nèi)膜損傷區(qū)的巨噬細(xì)胞共定位，5-LOX強(qiáng)效抑制劑VIA-2291可劑量依賴性地降低急性冠脈綜合癥患者斑塊的不穩(wěn)定性［12］;在ApoE－/－小鼠AS模型上，F(xiàn)LAP在主動(dòng)脈中上調(diào)最多，F(xiàn)LAP抑制劑MK-886可明顯降低斑塊面積。

Fig 5 Effect of ligustrazine on the protein expression of p-STAT3 in coronary endothelial cells induced by LPS(±s，n=4)

本研究在LPS誘導(dǎo)體外AS炎癥反應(yīng)模型上的結(jié)果表明，LIG可有效抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞COX-2、5-LOX及 FLAP蛋白表達(dá)，且與其阻斷MAPK磷酸化激活密切相關(guān)。因此，抑制AA通路炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮功能是LIG抗AS關(guān)鍵始動(dòng)環(huán)節(jié)。

3.2 抑制MAPK和JAK2/STAT3通路活化為其抗AS形成的新途徑 MAPK信號(hào)途徑的激活很可能是各種致AS病變因素的共同通路，p38MAPK途徑參與對炎癥因子、黏附分子的調(diào)控，促進(jìn)AS進(jìn)程。MAPK磷酸化水平升高與AS患者頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)膜增厚關(guān)系密切。有研究表明，AA可通過MAPK激活蛋白激酶2促進(jìn)5-LOX在Ser-271部位的磷酸化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［13］。本研究表明，LIG通過下調(diào)p38MAPK磷酸化而抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞AA通路炎癥因子 COX-2、5-LOX及 FLAP表達(dá)，p-p38MAPK特異性抑制劑SB203580逆轉(zhuǎn)LIG的內(nèi)皮保護(hù)作用。提示，LIG抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮AA通路激活是通過MAPK通路實(shí)現(xiàn)。

抑制內(nèi)皮細(xì)胞JAK2/STAT3通路的激活，可明顯抑制EC炎癥反應(yīng)，對抗EC損傷，有報(bào)道，JAK2特異性抑制劑AG490可明顯抑制牛主動(dòng)脈EC中LDH滲出，降低黏附分子 PECAM-1表達(dá)，抑制STAT3磷酸化激活［14］。本研究中，LIG通過下調(diào)STAT3磷酸化蛋白的表達(dá)而抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷作用，JAK2特異性抑制劑AG490可翻轉(zhuǎn)LIG的內(nèi)皮保護(hù)作用。提示抑制JAK2/STAT3通路激活是LIG抗LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮AA通路炎癥反應(yīng)的另一新型通路。因此，抑制內(nèi)皮MAPK和JAK2/STAT3通路激活為LIG抗AS形成的新途徑。

［1］Libby P，Ridker P M，Hansson G K.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis［J］.Nature，2011，473(7347):317－25.

［2］Koenen R R，von Hundelshausen P，Nesmelova I V，et al.Disrupting functional interactions between platelet chemokines inhibits atherosclerosis in hyperlipidemic mice［J］.Nat Med，2009，15(1):97－103.

［3］Furchgott R F，Zawadzki J V.The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine［J］.Nature，1980，288(5789):373－6.

［4］Puntmann V O，Bigalke B，Nagel E.Characterization of the inflammatory phenotype in atherosclerosis may contribute to the development of new therapeutic and preventative interventions［J］.Trends Cardiovasc Med，2010，20(5):176－81.

［5］Shih R H，Yang C M.Induction of heme oxygenase-1 attenuates lipopolysaccharide-induced cyclooxygenase-2 expression in mouse brain endothelial cells［J］.J Neuroinflamm，2010，7:86.

［6］Hui X，Li H，Zhou Z，Xu A.Adipocyte fatty acid-binding protein modulates inflammatory responses in macrophages through a positive feedback loop involving c-Jun NH2-terminal kinases and activator protein-1［J］.J Biol Chem，2010，285(14):10273－80.

［7］Choi J H，Jeon H J，Park J G，et al.Anti-atherogenic effect of BHB-TZD having inhibitory activities on cyclooxygenase and 5-lipoxygenase in hyperlipidemic mice［J］.Atherosclerosis，2010，212(1):146－52.

［8］Sampson A P.FLAP inhibitors for the treatment of inflammatory diseases［J］.Curr Opin Investig Drugs，2009，10(11):1163－72.

［9］李建生，劉敬霞，王 冬，等.大黃苷元注射抗大鼠腦缺血損傷炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(1):114－8.

［9］Li J S，Liu J X，Wang D，et al.Rhubarb aglycone injection antagonism to inflammatory cascade reaction of rats with cerebral ischemia injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(1):114－8.

［10］崔 磊，王守訓(xùn)，劉新泳.川芎嗪在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用和機(jī)制［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(22):3491－2.

［10］Cui L，Wang S X，Liu X Y.The effective mechanism of tetramethylpyrazine in anti-atherosclerosis［J］.Med Recap，2008，14(22):3491－2.

［11］Poeckel D，Zemski Berry K A，Murphy R C，et al.Dual 12/15-and 5-lipoxygenase deficiency in macrophages alters arachidonic acid metabolism and attenuates peritonitis and atherosclerosis in ApoE knock-out mice［J］.J Biol Chem，2009，284(31):21077－89.

［12］Cao R Y，St Amand T，Habenicht A J.Genetic and pharmacological inhibition of the 5-lipoxygenase/leukotriene pathway in atherosclerotic lesion development in ApoE deficient mice［J］.Atherosclerosis，2009，203(2):395－400.

［13］Werz O，Szellas D，Steinhilber D，et al.Arachidonic acid promotes phosphorylation of 5-lipoxygenase at Ser-271 by MAPK-activated protein kinase 2(MK2)［J］.J Biol Chem，2002，277(17):14793－800.

［14］Neria F，Caramelo C，Peinado H，et al.Mechanisms of endothelial cell protection by blockade of the JAK2 pathway［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(3):C1123－31.