川芎嗪對腫瘤介導(dǎo)的血液高凝的影響

王 生，趙 楊，陶 麗，王愛云，陳文星，鄭仕中，2，陸 茵，2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一級學(xué)科，江蘇南京 210046)

大量的臨床病例資料顯示［1－3］惡性腫瘤患者會表現(xiàn)出血液的高凝狀態(tài)，隨著腫瘤惡化程度加深，血液高凝狀態(tài)加劇。1865年Trousseau首先報道癌癥患者有自發(fā)凝血傾向，后來被大量臨床研究所證實，稱之為Trousseau綜合征［4－5］。國內(nèi)外大量研究表明［6－7］，絕大多數(shù)腫瘤細胞首先通過降解細胞外基質(zhì)，從原發(fā)位脫離進入血液環(huán)境，隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞在進入血液環(huán)境中時，腫瘤細胞自身表達的與凝血相關(guān)的蛋白及分泌到血液中的凝血相關(guān)因子，會引起凝血系統(tǒng)的改變，進而引起腫瘤介導(dǎo)的高凝狀態(tài)的發(fā)生。腫瘤介導(dǎo)的高凝狀態(tài)在一定程度上促進了腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移，也同時促進了腫瘤高凝狀態(tài)的發(fā)生和發(fā)展，兩者互為因果，在腫瘤的病情發(fā)展中具有重要的作用［8－9］。目前臨床上已經(jīng)有部分抗凝血的藥物應(yīng)用于腫瘤的輔助治療，代表性的抗凝藥物肝素［10］。

川芎嗪為活血化瘀中藥川芎主要的有效成分，現(xiàn)在已經(jīng)作為臨床上心血管類疾病療效確切的一線藥物，川芎嗪藥理作用廣泛，具有很好的抗凝血、抑制血小板聚集，改善微循環(huán)，抗血栓改善血液流變學(xué)，調(diào)節(jié)免疫功能，在抗腫瘤研究方面也有較多的報道［11－12］，但是對于其抗腫瘤作用是否與改善腫瘤介導(dǎo)的高凝狀態(tài)有關(guān)目前還沒有報道。本文圍繞川芎嗪的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用和腫瘤介導(dǎo)的高凝狀態(tài)的相關(guān)性開展基礎(chǔ)研究，以期為臨床治療腫瘤的思路提供實驗參考。

1 材料

1.1 實驗動物 C57BL6實驗小鼠，♀，6～8周齡，18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2 細胞株 B16F10黑色素瘤細胞株為本實驗室收藏，于含1×106·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素以及10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 實驗藥物及試劑 鹽酸川芎嗪注射液，上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司，批號110111912，規(guī)格2 ml/40 mg。凝血試劑盒(APTT、PT、TT)，北京世帝科學(xué)儀器公司，批號ST20201-38。纖維蛋白原FIB，南京建成生物工程研究所，貨號F010。肝素鈉(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司，貨號11011912)。纖維蛋白肽A(FPA)ELISA試劑盒(貨號 E1237m，96T，Uscnlife)。凝血因子 FXIII ELISA試劑盒(貨號EF1013-1，96T，AssayMax)。uPA ELISA 試劑盒(貨號 FA02837B，96T，R＆D)。tPA ELISA 試劑盒(貨號BH8914，96T，R＆D)。小鼠纖溶酶原激活物抑制因子 PAI ELISA 試劑盒(貨號 QS42803，96T，R＆D)。MTS(Promega公司，批號:G111A 22258402)。

1.4 實驗儀器 酶標(biāo)儀(美國 MD公司，型號:SPECTRA MAX 190以及SPECTRA MS)，萊卡倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司，型號DMIL)，電子天平(德國賽多利斯有限公司，型號BT323S)，凝血分析儀，高速冷凍離心機(美國Beckman公司，型號GS-15R)。

2 方法

2.1 體外細胞增殖 用含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)期細胞，胰酶消化后離心計數(shù)，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4.5×107·L－1，種96孔板，每孔180 μl細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)至細胞增長至80%左右時，加藥物或?qū)φ杖苊椒跤?4 h，之后每孔加入MTS試劑20 μl，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)3 h，在490 nm波長下測定吸光度OD。

2.2 實驗性轉(zhuǎn)移模型 60只♀C57BL6小鼠，6～8周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后按體重隨機分為6組，每組10只，即正常組、模型組、陽性藥組、川芎嗪8、24、72 mg·kg－1。RPMI 1640培養(yǎng)液加上10%小牛血清于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)B16F10細胞，取對數(shù)期細胞用胰酶消化離心計數(shù)，用PBS制備濃度為2.5×109·L－1的細胞懸液，置冰上備用。除正常組外，其他各組小鼠均尾靜脈注射0.2 ml細胞懸液復(fù)制實驗性轉(zhuǎn)移模型。第2天模型組給予生理鹽水作為對照，陽性藥組腹腔注射給予肝素(10 mg·kg－1)，川芎嗪低、中、高劑量分別按照 8、24、72 mg·kg－1腹腔注射給藥，連續(xù)給藥23 d。實驗性轉(zhuǎn)移模型小鼠給藥23 d后，小鼠處死前稱重，解剖取肺、肝、脾、胸腺器官，稱重后肺保存于10%甲醛溶液中，固定1周后拍照。器官指數(shù)按照以下公式計算，器官指數(shù)/%=器官重量/體重×100%。

2.3 凝血四項 APTT、PT、TT、FIB檢測 實驗性轉(zhuǎn)移小鼠給藥期間在7、14、21 d心臟取抗凝血，抗凝劑為3.8%枸櫞酸，2 500×g離心15 min，分離上清得到血漿，立即上機檢測，具體操作參照凝血四項(APTT、PT、TT、FIB)說明書。

2.4 血漿中纖溶因子及纖維蛋白相關(guān)因子指標(biāo)檢測 實驗性轉(zhuǎn)移模型小鼠給藥23 d后，摘眼球取抗凝血，抗凝劑為 3.8%枸櫞酸，3 000 r·min－1離心10 min分離上清得到血漿，利用ELISA試劑盒測定血漿中纖維蛋白穩(wěn)定因子FXIII、纖維蛋白肽A、t-PA、u-PA、PAI。具體實驗操作參照相應(yīng)的ELISA試劑盒說明書。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，實驗結(jié)果用±s表示。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪對細胞增殖影響很小 體外不同濃度的川芎嗪處理B16F10細胞24 h，只有當(dāng)川芎嗪100 μmol·L－1時會對B16F10增殖有一定的抑制作用，其他濃度對細胞增殖均無影響。

3.2 川芎嗪可以抑制腫瘤的血行轉(zhuǎn)移 B16F10黑色素瘤實驗性轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示模型組小鼠肺部均有黑色轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)出現(xiàn)，實驗性轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建成功，腹腔注射給予川芎嗪23 d后，處死小鼠分離肺組織，整體動物實驗結(jié)果表明川芎嗪可以抑制B16F10實驗性轉(zhuǎn)移，24、72 mg·kg－1劑量組明顯減少肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量(Fig 1A)，但是對實驗性轉(zhuǎn)移小鼠肺重?zé)o影響(Fig 1B)。B16F10實驗性轉(zhuǎn)移小鼠模型組與正常組相比，肝、脾、胸腺指數(shù)均降低，川芎嗪24、72 mg·kg－1劑量組可以一定程度的增加肝、脾、胸腺的器官指數(shù)，其中對脾和胸腺影響較大(Fig 2)。

Fig 2 Effects of Ligustrazine on immune organ index of experimental metastasis mice at 23 day

3.3 川芎嗪能夠改善腫瘤介導(dǎo)的高凝狀態(tài)B16F10實驗性轉(zhuǎn)移小鼠給予川芎嗪7、14、21 d時血漿凝血時間APTT、PT、TT，凝血時間測定結(jié)果表明模型組小鼠與正常組相比在7 d時，PT、TT降低表現(xiàn)出高凝狀態(tài)，14、21 d 時 PT、TT、APTT 進一步減小，隨著時間延長高凝狀態(tài)加劇(Fig 3)。川芎嗪不同劑量組在不同時間點均表現(xiàn)出程度不同的延長APTT(Fig 3A)，7 d時模型組小鼠APTT與正常組相比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，72 mg·kg－1劑量組能夠延長 APTT，與模型組相比(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。14 d時模型組與正常組相比，APTT明顯降低(P＜0.01)，陽性藥肝素可以延長APTT，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，8、24、72 mg·kg－1劑量組可以劑量依賴性的延長APTT。21 d時APTT與14 d相比進一步降低，陽性藥肝素可以延長APTT，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，72mg·kg－1劑量組能夠明顯延長APTT(P＜0.01)。小鼠血漿PT(Fig 3B)，模型組與正常組相比，14、21 d PT 明顯降低(P＜0.01)，8、24、72 mg·kg－1劑量組可以不同程度的延長PT。小鼠血漿TT(Fig 3C)，模型組與正常組相比，7、14、21 d TT 降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，24、72 mg·kg－1劑量組在7、14 d可以延長TT，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在21 d，川芎嗪各劑量組對TT無影響。纖維蛋白原測定結(jié)果顯示，在7、14、21 d模型組小鼠與正常組相比，纖維蛋白原含量明顯增加(Fig 4)，川芎嗪治療7 d時，24、72 mg·kg－1可以降低纖維蛋白原的含量(Fig 4B)，川芎嗪治療14、21 d時，可以劑量依賴性的降低纖維蛋白原的含量(Fig 4C，D)。

Fig 3 Ex vivo APTT，PT，and TT effects of Ligustrazine，Heparin in experimental metastasis mice at 7，14，21 day

Fig 4 Plasma fibrinogen(FIB)effects of Ligustrazine in experimental mice at 7，14，21 day

3.4 川芎嗪可以影響纖維蛋白的形成 纖維蛋白的形成是凝血激活標(biāo)志，川芎嗪很可能影響纖維蛋白進而改善腫瘤引起的血液高凝。在血液中與纖維蛋白聯(lián)系密切的因子很多，但是其中最重要的分別是纖溶系統(tǒng)中的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)、組織性纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)、凝血因子13(FXIII)以及纖維蛋白形成過程中的副產(chǎn)物纖維蛋白肽A(FPA)。血漿中FXIII模型組較正常組增高，模型組纖維蛋白的穩(wěn)定性增強，但是川芎嗪各劑量組與模型組相比對FXIII并無影響(Fig 5A)，血漿中PAI的含量，模型組與正常組相比表達增加，川芎嗪可以劑量依賴性的降低血漿中PAI的表達(Fig 5B)，血漿中t-PA含量，模型組與正常組相比表達降低，而川芎嗪可以劑量依賴性的升高血漿中t-PA的含量(Fig 5C)，血漿中uPA表達，模型組與正常組相比無明顯變化，而川芎嗪各劑量組對血漿中uPA表達亦無影響(Fig 5D)，血漿中FPA的含量，模型組較正常組明顯升高，川芎嗪24、72 mg·kg－1可以降低血漿中FPA的含量，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 5E)。因此腫瘤激活血液系統(tǒng)引起血液的高凝狀態(tài)，一方面是通過增強纖維蛋白的穩(wěn)定性，一方面是影響纖溶系統(tǒng)，提高PAI的表達，同時降低t-PA的表達，使纖維蛋白的降解減少，此外還可以增加纖維蛋白的形成，最終使纖維蛋白的含量升高表現(xiàn)出血液高凝。川芎嗪可以影響上述的3個環(huán)節(jié)，很好的改善腫瘤介導(dǎo)的高凝狀態(tài)。

Fig 5 Effects of Ligustrazine on formation and stability of fi-brin with El

4 討論

雖然大量的臨床資料表明腫瘤病人都會表現(xiàn)出一定程度的血液高凝，且隨著腫瘤惡化進程，血液高凝會加劇，但是對于兩者之間的相關(guān)性很多研究者持否定的態(tài)度。本文通過實驗性的肺轉(zhuǎn)移模型發(fā)現(xiàn)模型組小鼠與正常組小鼠相比，凝血時間明顯縮短，表現(xiàn)出血液的高凝狀態(tài)，且隨著轉(zhuǎn)移時間的延長，模型組小鼠凝血時間進一步縮短，血液高凝狀態(tài)加劇，很好的支撐了臨床資料。基于臨床發(fā)現(xiàn)腫瘤患者與血液高凝之間的相關(guān)性，臨床上已經(jīng)開始使用肝素等抗凝藥物用于惡性腫瘤的輔助治療，而此類藥物在惡性腫瘤的治療上表現(xiàn)出一定的效果和優(yōu)勢。

腫瘤治療上傳統(tǒng)中藥的使用有一定的療效，其中活血化瘀中藥的使用具有較高的頻率。在很多的抗腫瘤經(jīng)驗方中，活血化瘀類中藥丹參、赤芍、丹皮、當(dāng)歸、川芎都有一定的使用［13－14］。但是目前臨床上就活血化瘀中藥抗腫瘤方面的應(yīng)用有不同的觀點，同時在臨床抗腫瘤療效上也有相反的結(jié)果出現(xiàn)［15］。有部分學(xué)者提出活血化瘀中藥的抗腫瘤應(yīng)用要遵循辨癥施治原則，根據(jù)腫瘤患者惡化時間及血液指標(biāo)的變化確定活血化瘀中藥的使用時間。不是所有的腫瘤患者都會表現(xiàn)出血液的高凝狀態(tài)，一般發(fā)生轉(zhuǎn)移晚期腫瘤患者才會表現(xiàn)出血液高凝。臨床上活血化瘀中藥抗腫瘤相反的藥效可能與活血化瘀中藥的不同使用時間和血液狀態(tài)有關(guān)。本文研究利用實驗性轉(zhuǎn)移模型直接復(fù)制腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡化階段，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)移過程中血液表現(xiàn)出高凝狀態(tài)，此時使用活血化瘀中藥干預(yù)能夠很好的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

近幾年國外對于免疫治療腫瘤的研究有很多的報道，癌栓的形成使腫瘤細胞在機體內(nèi)轉(zhuǎn)移成為可能，腫瘤細胞作為異物進入血液，表面具有抗原表位，會被機體免疫系統(tǒng)識別和殺傷［16］。在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生初期，絕大部分腫瘤細胞被NK細胞殺死，極少數(shù)腫瘤細胞逃過免疫監(jiān)視，進而能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)移［17－18］。國外大量研究資料已經(jīng)表明［19］腫瘤在入血后會激活凝血系統(tǒng)，激活血小板、促進纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，而纖維蛋白原可以介導(dǎo)活化的血小板粘附在腫瘤細胞表面形成癌栓，掩蓋抗原表位，進而使免疫系統(tǒng)不能識別腫瘤細胞，同時阻斷NK細胞與腫瘤細胞的直接接觸，阻斷NK細胞對腫瘤的免疫殺傷作用。因此腫瘤介導(dǎo)的凝血激活會進一步促進腫瘤癌栓的形成，達到轉(zhuǎn)移和惡化的目的。對于活血化瘀中藥的抗腫瘤研究應(yīng)更深入的圍繞癌栓的形成和免疫殺傷展開，該部分還在進一步的研究中。

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