王 丹，史紅艷，余靜丹，周佳琦，李菁華，孫延波

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春130021）

陰溝腸桿菌噬菌體ФEc53的分離及鑒定

王 丹，史紅艷，余靜丹，周佳琦，李菁華，孫延波

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春130021）

目的：以14株陰溝腸桿菌為宿主菌，從環(huán)境污水中分離噬菌體，分析其生物學(xué)特性，鑒定其分型。方法：采用雙層瓊脂噬斑法分離并鑒定噬菌體。純化后的噬菌體經(jīng)負(fù)染法染色，通過電鏡觀察其大小和形態(tài)；提取噬菌體基因組，進(jìn)行酶切電泳分析；通過裂解譜的分析，確認(rèn)噬菌體的特異性和裂解宿主菌范圍。結(jié)果：成功分離1株裂解性噬菌體，電鏡顯示噬菌體的頭部呈球形，直徑約60 nm，尾部長(zhǎng)約130 nm。瓊脂糖凝膠電泳顯示其基因組約40000 bp，且含多種酶切位點(diǎn)。特異性實(shí)驗(yàn)顯示其呈現(xiàn)較窄的宿主范圍。結(jié)論：分離的陰溝腸桿菌噬菌體（命名為ФEc53）屬于有尾病毒目，管尾病毒科，是一種特異性高、裂解性強(qiáng)的毒性噬菌體。

噬菌體；陰溝腸桿菌；細(xì)菌耐藥

陰溝腸桿菌屬腸桿菌科細(xì)菌，為革蘭氏陰性桿菌，具有鞭毛，能利用檸檬酸鹽作為碳源，可發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。陰溝腸桿菌廣泛分布于自然界，亦可存在于人和動(dòng)物的腸道中。陰溝腸桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見的致病菌之一［1］，可引起呼吸道感染、尿道感染、敗血癥和腹膜炎等。國(guó)內(nèi)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)［2］顯示：陰溝腸桿菌對(duì)β－內(nèi)酰胺酶類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素均表現(xiàn)了較高的耐藥率，這為陰溝腸桿菌感染的抗生素療法造成一定的困難。噬菌體是侵襲細(xì)菌的病毒，存在于自然界的環(huán)境中，利用其對(duì)細(xì)菌裂解的特異性和高效性，噬菌體除可用于細(xì)菌的分型鑒定外，在多重耐藥菌株的治療、食品加工衛(wèi)生和生態(tài)環(huán)境的凈化等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景［3］。雖然噬菌體的研究開展已久，但國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)陰溝腸桿菌噬菌體的深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過雙層瓊脂噬斑法從環(huán)境中分離1株針對(duì)陰溝腸桿菌的裂解性噬菌體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步的分析及鑒定，為進(jìn)一步研究陰溝腸桿菌噬菌體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑與儀器 14株陰溝腸桿菌來自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，菌株經(jīng)法國(guó)生物梅里埃公司VITEK－32全自動(dòng)微生物分析鑒定系統(tǒng)鑒定。營(yíng)養(yǎng)瓊脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），胰蛋白胨和酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），Agar瓊脂粉（Bacteriological Grade公司），脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ）、Tris－飽 和 酚（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A）（Sigma公司），氯仿（天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司），PEG 8000（天佳生物技術(shù)有限公司），蛋白酶 K（Bacteriological Grade公司），Eco RⅠ、Eco RⅤ和NdeⅠ（Takara公司）。

1.216 S r RNA陰溝腸桿菌PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank查詢陰溝腸桿菌16 S r RNA基因序列（Accession：NC＿04121），并設(shè)計(jì)引物，通過多聚酶鏈反應(yīng)，進(jìn)一步確認(rèn)陰溝腸桿菌。設(shè)計(jì)序列如下：上游引物，5′－TCCACAGAACTTTCCAGAGATG－3′； 下 游 引 物，5′－CCTACGGTTACCTTGTTACGACTT－3′。擴(kuò)增目的基因片段的長(zhǎng)度為519 bp，PCR反應(yīng)條件：95℃、5 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃、10 min。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.3 噬菌體的分離和純化 取500 m L污水，加入固體CaCl2至終濃度1 mmol·L－1，5000 r·min－1離心10 min，取上清255 m L置于1000 m L三角燒瓶中，加50 m L Luria－Bertani（LB）培養(yǎng)基和14株陰溝腸桿菌菌液各1 m L，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。10000 r·min－1離心 5 min，取上清用0.22μm濾膜濾過除菌。分別以14株陰溝腸桿菌為宿主菌，與濾過液混合靜止15 min，加入融化的0.7%LB瓊脂（50℃）并均勻地鋪在固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16～18 h，觀察噬菌斑的形成情況。噬菌斑形成時(shí)，挑取單個(gè)噬菌斑接種至對(duì)應(yīng)的宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增，單個(gè)噬菌斑經(jīng)3～5次反復(fù)純化后可得到較純化的噬菌體。

1.4 噬菌體的電鏡觀察 取純化的噬菌體懸液20μL滴于銅網(wǎng)上，待其自然沉淀15 min，用濾紙從側(cè)面吸干多余的液體，加1滴2%磷鎢酸到銅網(wǎng)上，染色10 min，干燥后進(jìn)行電鏡觀察。

1.5 噬菌體核酸提取和酶切圖譜 參照文獻(xiàn)［4］的方法，在噬菌體懸液中加入DNaseⅠ至終濃度5 mg·L－1，RNase A至1 mg·L－1，37℃溫育1 h。加入EDTA（p H 8.0）至終濃度20 mmol·L－1，加蛋白酶K至終濃度50 mg·L－1，加十二烷基硫酸鈉（SDS）至終濃度0.5%，56℃溫育1 h。用等體積平衡酚（p H 8.0）抽提離心，收集水相，再用等體積氯仿抽提1次，收集水相。加入體積比為1∶10醋酸鈉 NaAc（3 mol·L－1，p H 5.2），于2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀核酸，干燥后用100μL雙蒸水溶解核酸，－20℃保存。提取的噬菌體核酸用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Eco RⅤ和NdeⅠ進(jìn)行酶切電泳分析。

1.6 宿主菌的特異性判定和裂解譜實(shí)驗(yàn) 分別將大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和14株陰溝腸桿菌（編號(hào)分別為03、04、05、06、7、8、53、87、89、136、146、213、1121和1155）接種至LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)A590值為0.2時(shí)，將細(xì)菌培養(yǎng)液置于冰箱（4℃）2 h后，分別加入純化的噬菌體100μL，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，測(cè)其A590值。該方法重復(fù)3次。計(jì)算加入噬菌體前后的A590值差值的平均值，判定噬菌體對(duì)細(xì)菌的特異性和裂解譜的范圍。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的鑒定 PCR擴(kuò)增陰溝腸桿菌16S r RNA基因部分序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見500 bp左右大小的特異性條帶，與預(yù)期值相符（目的片段為519 bp），而質(zhì)控菌株大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的PCR產(chǎn)物則為陰性。見圖1。

2.2 噬菌體的噬菌斑的形態(tài) 采用雙層瓊脂法分離出1株陰溝腸桿菌噬菌體，命名為ФEc53。噬菌體在雙層瓊脂平板上形成圓形、透明，噬菌斑直徑為2～4 mm。單個(gè)噬菌斑經(jīng)3～5次反復(fù)純化后，測(cè)得噬菌體滴度為2.5×1010PFU·mL－1。見圖2。

圖1 陰溝腸桿菌16S rRNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR amplification of 16S r RNA of Enterobacter cloacae

圖2 陰溝腸桿菌噬菌體噬菌斑Fig.2 The plaques of Enterobacter cloacae bacteriophages

2.3 電鏡觀察噬菌體的形態(tài) 純化后的噬菌體經(jīng)負(fù)染后，電鏡下噬菌體的頭部呈球形，直徑約60 nm，有一長(zhǎng)尾約130 nm，根據(jù)噬菌體新的分類法，噬菌體ФEc53屬于有尾病毒目、管尾病毒科。見圖3。

圖3 陰溝腸桿菌噬菌體ФEc53電鏡圖像Fig.3 Electron micrograph of Enterobacter cloacae bacteriophageФEc53

2.4 噬菌體基因組的酶切鑒定 噬菌體ФEc53基因組經(jīng)3種限制性內(nèi)切酶酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，噬菌體ФEc53基因組含Eco RⅠ、Eco RⅤ和NdeⅠ的多個(gè)酶切位點(diǎn)，根據(jù)Quantity One軟件的比對(duì)和分析，噬菌體ФEc53基因組大小約為40000 bp。見圖4。

圖4 噬菌體ФEc53基因組的酶切電泳圖Fig.4 Electrophoregram of enzyme digestion of genome profiles of Enterobacter cloacae bacteriophageФEc53

2.5 宿主菌的特異性和裂解范圍 為進(jìn)一步確認(rèn)噬菌體的特異性和裂解譜的范圍，觀察不同宿主菌（14株陰溝腸桿菌、大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853）在與噬菌體作用前后的含量變化。在所試菌株中只有1株陰溝腸桿菌（編號(hào)為53）對(duì)所分離的噬菌體敏感，其他細(xì)菌在與噬菌體作用后繼續(xù)生長(zhǎng)（細(xì)菌的含量增加）。見表1。

3 討 論

陰溝腸桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見的條件致病菌之一，特別是在免疫缺陷和器官移植的患者中，陰溝腸桿菌可引起呼吸道感染、尿路感染、腹膜炎和敗血癥等疾病。2010年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥報(bào)告［5］顯示：陰溝腸桿菌在臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌中已上升至第3位，此外，由于抗生素的長(zhǎng)期和不合理應(yīng)用所造成的選擇性壓力增高，陰溝腸桿菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素出現(xiàn)了較高的耐藥率［6］，并且通過耐藥性變異形成新型耐藥機(jī)制［7－8］，這是臨床抗感染面臨的難題。噬菌體是能夠特異感染細(xì)菌的病毒，廣泛分布于自然界，分離純化和制備噬菌體用以預(yù)防和治療細(xì)菌性感染的研究倍受關(guān)注。

表1 宿主菌的特異性和裂解范圍Tab.1 The specificity and cracking range of host baterium

本研究采用雙層瓊脂噬斑法從環(huán)境的污水中分離出1株陰溝腸桿菌噬菌體（ФEc53），在雙層瓊脂平板上可形成清晰的噬菌斑。有關(guān)陰溝腸桿菌噬菌體的研究國(guó)內(nèi)至今尚未見報(bào)道，本次分離的陰溝腸桿菌噬菌體ФEc53，有一長(zhǎng)尾（約130 nm），無(wú)收縮尾鞘，頭部呈球形（多面體立體對(duì)稱），直徑約60 nm，無(wú)囊膜。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)分類標(biāo)準(zhǔn)［9］，該噬菌體屬于有尾病毒目，管尾病毒科。目前所分離到的噬菌體絕大多數(shù)屬有尾病毒目［10］，分屬3個(gè)科，即肌尾病毒科、管尾病毒科和短尾病毒科?，F(xiàn)已知管尾病毒科的特征是尾部較長(zhǎng)（64～570 nm），無(wú)收縮尾鞘，頭部為正多面體，雙鏈DNA。本研究采用Quantity One軟件比對(duì)和初步分析顯示：噬菌體ФEc53基因組約為40000 bp；限制性內(nèi)切酶分析表明：Eco RⅠ的酶切位點(diǎn)有9個(gè)，Eco RⅤ有15個(gè)酶切位點(diǎn)，NdeⅠ則有7個(gè)酶切位點(diǎn)。而在GenBank登錄（HQ 641380.1）的陰溝腸桿菌噬菌體的基因組大約59000 bp，Eco RⅠ的酶切位點(diǎn)有15個(gè)，Eco RⅤ的酶切位點(diǎn)有37個(gè)，NdeⅠ有27個(gè)位點(diǎn)。因此，此次分離的陰溝腸桿菌噬菌體與已在GenBank登錄的噬菌體有明顯的不同。

宿主菌裂解譜的研究證明：噬菌體ФEc53僅能裂解1株陰溝腸桿菌，對(duì)其他分離并鑒定的陰溝腸桿菌不敏感，說明噬菌體ФEc53對(duì)其他來源的陰溝腸桿菌無(wú)特異性，同時(shí)也反映出不同菌株的陰溝腸桿菌其表面的受體無(wú)法被噬菌體ФEc53所識(shí)別，進(jìn)而不能感染和裂解不同來源的同種宿主菌。這種嚴(yán)格的特異性在噬菌體抗細(xì)菌感染的實(shí)際操作中受到一定的限制。為克服這一不足，通常采用所謂的噬菌體的 “雞尾酒”療法［11］，即將含有多株噬菌體的制劑用來治療和預(yù)防某種細(xì)菌的感染。因此，在進(jìn)一步的研究中，一方面應(yīng)分離和篩選裂解譜寬的噬菌體，另一方面應(yīng)分離多株陰溝腸桿菌噬菌體組成 “雞尾酒”制劑，以探討針對(duì)陰溝腸桿菌特別是耐藥性陰溝腸桿菌的感染的治療和預(yù)防。

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Isolation and identification of Enterobacter cloacae bacteriophagesФEc53

WANG Dan，SHI Hong－yan，YU Jing－dan，ZHOU Jia－qi，LI Jing－h(huán)ua，SUN Yan－bo
（Department of Pathogenobiology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To isolate bacteriophages from raw sewage and to investigate the biological properties of bacteriophages using 14 strains of Enterobacter cloacae as host cells，and to identify its structure.Methods Bacteriophages were isolated from sewage with double－agar and identified by plaque method.After purification and negative－staining of bacteriophages，the morphologic features of bacteriophages were examined by electron microscope，the bacteriophage genome was extracted for electrophoresis；the lytic spectrum of host was carried out for specificity and cracking range of the Enterobacter cloacae.Results BacteriophageФEc53 was isolated and identified，electron micrograph showed that the head of bacteriophage was spherical，60 nm in diameter and it had a tail，about 130 nm long.Electrophoresis of phage DNA revealed that the size of genome was about 40000 bp and contained lots of restriction sites.The lytic spectrum trial showed it had a relatively narrow host range.Conclusion The isolated Enterobacter cloacae（namedФEc53）bacteriophage belongs to Caudovirales，Siphoviridae.According to its biologic features，bacteriophageФEc53 has strong lytic and high specificity.

bacteriophages；Enterobacter cloacae；drug－resistant bacteria

R378.2

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1077－04

2012－06－21

國(guó)家自然科學(xué)基金委主任基金資助課題（81150037）

王 丹（1987－），女，吉林省長(zhǎng)春市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事噬菌體分子遺傳學(xué)研究。

李菁華（Tel：0431－85619574，E－mail：ljh＠jlu.edu.cn）；孫延波（Tel：0431－85619574，E－mail：sunyb＠jlu.edu.cn）