丁瑞峰，王愛魚，王宏杰，郭元虎，趙鵬程

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古包頭014010)

功能性胃腸病(functional gastrointestinal disorders，F(xiàn)GIDs)是以消化系統(tǒng)癥狀為臨床表現(xiàn)，而應(yīng)用生化、影像學(xué)和內(nèi)鏡檢查等并未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變的一類胃腸道疾?。?］。認(rèn)為其發(fā)病與內(nèi)臟感覺、炎性反應(yīng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能等因素有關(guān)，而內(nèi)臟高敏感是功能性胃腸病癥狀產(chǎn)生的主要原因之一。Cajal間質(zhì)細胞(interstitial celIs of cajal，ICC)被認(rèn)為是胃腸慢波的起搏細胞，是調(diào)節(jié)胃腸運動的重要環(huán)節(jié)［2］。本研究通過直腸注射冰醋酸建立內(nèi)臟高敏感大鼠模型［3－4］，探討ICC在內(nèi)臟高敏感中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級新生Wistar大鼠［內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(蒙)2007-0001］，每8～10只與其母鼠共同飼養(yǎng)在同一箱內(nèi)，發(fā)育至25 d后，將母鼠與幼鼠分離。分離后的大鼠雌雄分離，每4只∕籠，給予足夠的食物、水。所有大鼠均在安靜室溫下飼養(yǎng)，晝夜控制為12 h周期。C-KIT一抗和 β-actin為兔多克隆抗體(武漢博士德公司)，二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立:參照文獻［3－4］，新生大鼠16只隨機分為2組，對照組大鼠自出生后8～21 d每日上午將石蠟油潤滑后的連續(xù)硬膜外導(dǎo)管(直徑1.0 mm)緩慢經(jīng)肛門插入0.5～1.0 cm，注入0.9%氯化鈉注射液0.3～0.5 mL，實驗組注入0.6%冰醋酸溶液0.3～0.5 mL。從第21天后不進行任何實驗操作。

1.2.2 腸道敏感性評估:8周齡時行直腸擴張(colorectal distention，CRD)，觀察大鼠腹部撤離反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分。清醒狀態(tài)下，將石蠟油潤滑后的8F導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插人，氣囊末端距離肛門1.0 cm。用膠布把導(dǎo)管和大鼠尾巴根部纏在一起，固定氣囊，將其放在特制的透明塑料籠(20 cm×8 cm×8 cm)內(nèi)，大鼠在此籠內(nèi)只能前后運動，不能轉(zhuǎn)身。大鼠適應(yīng)環(huán)境20 min后，進行直腸擴張。導(dǎo)管球囊內(nèi)快速注人0.9%氯化鈉注射液，觀察大鼠腹部撤離反射為3分時的注水量(腹背部肌肉較強收縮并把腹部抬離地面)。每次直腸擴張持續(xù)20 s，間隔3 min，重復(fù)進行3次，數(shù)據(jù)取均值。

1.2.3 取材:對大鼠進行評分后，予5%戊巴比妥過量麻醉處死。剖腹手術(shù)分離遠端結(jié)腸，切除降結(jié)腸組織2.0 cm，一部分標(biāo)本液氮冷凍過夜后－80℃冰箱保存，一部分標(biāo)本置入4%多聚甲醛液24 h固定，石蠟包埋，制成5μm厚的切片，貼在經(jīng)APES處理的載玻片，37℃溫箱烘干備檢。

1.2.4 免疫組化:石蠟切片梯度脫臘，0.3%甲醇-H2O2室溫孵育，封閉內(nèi)源性過氧化物酶;0.01 mol/L PBS漂洗，抗原修復(fù)標(biāo)本于檸檬酸緩沖液微鍋爐加熱，1%山羊血清封閉背景，吸去多余血清;加1∶50 C-KIT一抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗;1∶100生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG，室溫孵育2 h，PBS漂洗;新鮮配制DAB溶液顯色，DPX封片。顯微鏡下胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色片狀或顆粒狀物為C-KIT陽性反應(yīng)，每例取3張切片，每張切片取5個高倍鏡視野下的陽性細胞計數(shù)，取其平均值計算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5 蛋白印跡法:提取蛋白樣品80μg，SDSPAGE凝膠電泳分離，凝膠電泳儀初始電壓80 V，后提高電壓至100 V，用PVDF膜進行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，用5%TBS-T脫脂奶粉封閉。用TBS-T漂洗液洗膜，加入用適當(dāng)漂洗液稀釋的抗體(C-KIT為1∶200;β-actin 為1∶5 000)，4 ℃ 孵育過夜。TBS-T漂洗液洗膜3次，然后將PVDF膜移入另一新的雜交袋，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(C-KIT 為1∶2 000;β-actin 為1∶10 000)，37 ℃ 振蕩60 min，TBS-T漂洗液洗膜。加入化學(xué)發(fā)光劑曝光、顯影。蛋白圖像分析用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進行吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AWR評分

實驗組大鼠AWR為3分時的注水量為(1.37±0.31)mL，顯著低于對照組的(1.84±0.22)mL(P ＜0.05)。

2.2 C-KIT陽性細胞染色和C-KIT蛋白印跡

對照組與實驗組結(jié)腸組織中C-KIT陽性細胞分布、形態(tài)相似。主要分布在黏膜下ICC(ICC-SM)和肌間神經(jīng)叢ICC(ICC-MY)，在環(huán)肌層和縱肌層內(nèi)ICC(ICC-IM)也有分布。正常ICC多呈紡錘形，有2～5條長突起。實驗組大鼠結(jié)腸組織中C-KIT陽性細胞數(shù)顯著高于對照組(p＜0.05)(圖1，表1)。實驗組大鼠結(jié)腸組織中C-KIT蛋白表達明顯高于對照組(P ＜0.01)(圖2，表1)。

圖2 Western blot檢測大鼠結(jié)腸C-KIT蛋白表達Fig 2 Expression of C-KIT protein measured by Western blot in rat colon

3 討論

圖1 大鼠結(jié)腸C-KIT免疫組化Fig 1 C-KIT immunohistochemistry staining of colon of rats(×400)

表1 對照組和實驗組C-KIT陽性細胞計數(shù)和蛋白吸光度值比較Table 1 Comparison of C-KIT masculine cell counting and C-KIT protein absorbance value of control group and model group，n=8)

表1 對照組和實驗組C-KIT陽性細胞計數(shù)和蛋白吸光度值比較Table 1 Comparison of C-KIT masculine cell counting and C-KIT protein absorbance value of control group and model group，n=8)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group．

group C-KIT masculine cell counting C-KIT pro tein A value control 15.33±1.57 40.6±30.5 model 23.37±1.88* 134.5±47.5＊＊

內(nèi)臟高敏感表現(xiàn)為患者對胃腸刺激的疼痛閾值降低．甚至對正常胃腸功能狀態(tài)的敏感性增高，即異常性疼痛，與內(nèi)臟相對應(yīng)的軀體牽涉痛范圍擴大［5］。內(nèi)臟感覺由初級傳入神經(jīng)元產(chǎn)生，其神經(jīng)末梢與腸神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)末梢相互混合。ICC是胃腸慢波的起搏細胞，ICC周圍常伴有腸神經(jīng)纖維環(huán)繞，而且內(nèi)臟初級感覺神經(jīng)纖維還與ICC密切聯(lián)系，這為神經(jīng)信號傳遞提供了解剖基礎(chǔ)。ICC的一個重要功能是接收腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的信號傳遞，神經(jīng)的傳導(dǎo)不是通過神經(jīng)肌肉間松散的突觸結(jié)構(gòu)而是通過神經(jīng)末端和ICC之間的突觸樣連接。新近有研究證實環(huán)肌層和縱肌層內(nèi)ICC還與肌內(nèi)迷走神經(jīng)的膨體之間是以突觸樣聯(lián)系傳遞信號的［6］。ICC是腸神經(jīng)作用的首要靶細胞，擔(dān)當(dāng)了接受與傳遞興奮和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的作用，ICC細胞膜上存在多種受體如毒蕈堿 M2、M3受體、神經(jīng)激肽受體、VIP受體和5-HT受體，并可觀察到ICC對乙酰膽堿、NO、VIP、P物質(zhì)等神經(jīng)遞質(zhì)均有反應(yīng)性［7］。目前已證實腸神經(jīng)系統(tǒng)及多種神經(jīng)遞質(zhì)在外周、脊髓及中樞參與內(nèi)臟高敏感的調(diào)控。本實驗通過冰醋酸連續(xù)刺激新生期大鼠結(jié)腸致內(nèi)臟高敏感動物模型。該模型不影響大鼠的生長發(fā)育，成年后大鼠結(jié)腸組織學(xué)無明顯炎性反應(yīng)改變，適用于內(nèi)臟高敏感性的研究。本研究發(fā)現(xiàn)ICC在內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸中較對照組明顯增多，C-KIT蛋白表達在內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸中較對照組明顯增強。由于ICC與腸神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)臟初級感覺神經(jīng)纖維有緊密的聯(lián)系，ICC細胞膜上存在VIP、5-HT等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，因此，推測ICC可能參與了內(nèi)臟高敏感的形成，但其機制還有待進一步研究。

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