河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細(xì)胞室 劉 亮

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是70年代發(fā)展起來的一種快速對單細(xì)胞定量分析和分選的新技術(shù)，能定量分析細(xì)胞的生物化學(xué)成分。其檢測速度之快，統(tǒng)計(jì)學(xué)精度之高，是其他的方法無可比擬的，可同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測得多種參數(shù)(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞體積等)進(jìn)行多參數(shù)分析，為細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的手段。80年代時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)就已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的研究，已成為切實(shí)可行有效的研究方法，同時(shí)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中也得到了廣泛推廣應(yīng)用，在免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤、病理學(xué)、放射生物學(xué)等學(xué)科，并形成了獨(dú)特的學(xué)科分支，諸如流式免疫學(xué)、流式遺傳學(xué)、流式病理學(xué)、流式細(xì)胞酶學(xué)等。

近年來，隨著流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原，癌基因蛋白及膜受體的定量檢測取得了很大進(jìn)展，很多學(xué)者將流式免疫檢測技術(shù)用于臨床醫(yī)學(xué)，對疾病的診斷、治療、預(yù)后評價(jià)都起了重要作用。流式免疫技術(shù)克服了普通免疫學(xué)方法難以準(zhǔn)確定量的不足，形成了流式免疫學(xué)獨(dú)特的科學(xué)分支，成為研究細(xì)胞免疫學(xué)的先進(jìn)技術(shù)之一。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種新的熒光探針的不斷出現(xiàn)，使 FCM技術(shù)的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，特別是各種各樣的熒光探針標(biāo)記的單克隆抗體和其他蛋白質(zhì)的出現(xiàn)，為 FCM 研究各種組織細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)抗原、腫瘤性蛋白等開辟了新途徑，新的腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)，大大提高了FCM在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究水平，其發(fā)展速度之快，應(yīng)用層出不窮。

腫瘤尤其是惡性腫瘤成為目前威脅人們生命健康的主要疾病，腫瘤的早期診斷及治療對于提高患者的預(yù)后及生存期具有重大的意義，腫瘤的早期缺乏典型的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，這樣就給常規(guī)的病理檢測，進(jìn)行早期診斷帶來了困難。腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)給腫瘤早期診斷帶來了新的曙光。流式細(xì)胞術(shù)對于腫瘤標(biāo)志物的檢測具有客觀、檢測速度快、操作簡便、數(shù)據(jù)精確等優(yōu)點(diǎn)，適合于腫瘤標(biāo)志物的檢測，有效提高腫瘤早期診斷的正確率。流式細(xì)胞術(shù)之所以能夠檢測腫瘤標(biāo)志物，得益于流式細(xì)胞術(shù)與免疫學(xué)的結(jié)合形成的流式細(xì)胞免疫學(xué)。

流式免疫技術(shù)是研究以單細(xì)胞或單細(xì)胞核為基礎(chǔ)，并結(jié)合傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法，其基本原理是細(xì)胞上的抗原與相關(guān)的單克隆抗體結(jié)合，形成帶有熒光的抗原抗體復(fù)合物，通過流式細(xì)胞術(shù)測定其特定熒光量。目前流式免疫學(xué)染色方法有直接免疫熒光標(biāo)記法和間接免疫熒光標(biāo)記法，推薦使用直接免疫熒光標(biāo)記法，具有測定結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)就流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤免疫學(xué)中的應(yīng)用分述如下。

1 腫瘤基因蛋白產(chǎn)物的流式細(xì)胞術(shù)檢測

惡性腫瘤是一種多基因異常的疾病，它發(fā)生的分子基礎(chǔ)是原癌基因的激活和或抑癌基因的失活，導(dǎo)致某些細(xì)胞分化不良和增殖失控而形成腫瘤。目前研究發(fā)現(xiàn)，某些癌基因及抑癌基因蛋白可以作為腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤早期診斷。大量的與熒光素標(biāo)記的癌基因及抑癌基因蛋白單克隆抗體的出現(xiàn)，也使得流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤基因蛋白產(chǎn)物的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。

癌基因是指一大類促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，并具有潛在致癌或促癌作用的基因群，已發(fā)現(xiàn)的癌基因有：myc基因族，包括C-myc、N-myc、L-myc；ras基因族；fos、c-sis、c-abl、c-src、c-erbB-2等，抑癌基因則是一大類抑制細(xì)胞生長，對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用，并能潛在抑制癌作用的基因，包括DCC、NF-1、NF-2、RB、野生型p53、p16等，某些基因針對某種特定的組織或細(xì)胞才有意義，即各種組織來源的癌，應(yīng)有它特定的癌基因譜或抑癌基因譜，也有組織特異的基因群。

c-erbB-2基因，又稱neu基因，該基因通過蛋白產(chǎn)物的過度表達(dá)而與參與人類腫瘤發(fā)生。有研究報(bào)道，c-erbB-2基因蛋白在乳腺癌中高表達(dá)，除此之外，它還與卵巢癌、宮頸癌、胃癌、唾液腺癌、食管癌及膀胱癌等多種腫瘤有關(guān)。突變型p53基因?qū)侔┗?，它與結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌和白血病等有關(guān)。Rb基因蛋白與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、成骨肉瘤、軟組織肉瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌等有關(guān)。

利用抗基因蛋白產(chǎn)物的單克隆抗體對基因蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究，流式細(xì)胞分析技術(shù)在腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制研究方面有了很大進(jìn)展，從分子水平極大的推動(dòng)了對惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究進(jìn)展，并對腫瘤的診斷、預(yù)后檢測提供有用的標(biāo)志物。

2 淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤流式免疫表型分析

2.1 急性淋巴母細(xì)胞白血病免疫表型分析

急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)的免疫學(xué)分類進(jìn)展較快，其重點(diǎn)主要在于確定ALL的細(xì)胞來源和其成熟的階段。目前，對ALL尚無統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)，許多學(xué)者使用細(xì)胞特異性單克隆抗體輔以基因重排研究將ALL分為B細(xì)胞性、T細(xì)胞性和未分類ALL三種。流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞上特異性表達(dá)的抗原進(jìn)行檢測從而為ALL的分類提供診斷依據(jù)。

B細(xì)胞性ALL，CD19是ALL免疫表型分析最具價(jià)值的B細(xì)胞限制性單抗，是B細(xì)胞系統(tǒng)最早出現(xiàn)的特異性膜抗原，其出現(xiàn)早于CD10和CD20，且在漿細(xì)胞期以前持續(xù)存在。正常及惡性T細(xì)胞或髓性單核細(xì)胞無CD19表達(dá)。T-ALL的免疫表型可表現(xiàn)為胸腺細(xì)胞成熟過程的三個(gè)階段中任意階段的變化，不同階段有不同CD分子表達(dá)，但不管是處在哪一階段，幾乎均有CD7特異抗原的表達(dá)?，F(xiàn)在已有不同熒光素標(biāo)記的不同的CD的單克隆抗體，可以利用流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行精確、快速的測量，為ALL的分類提供診斷依據(jù)。

2.2 惡性淋巴瘤的流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析

使用熒光素標(biāo)記抗體的FCM細(xì)胞檢測已成為淋巴細(xì)胞免疫表型分析的一種有效方法。通過對淋巴細(xì)胞表面抗原進(jìn)行連續(xù)性評價(jià)可弄清淋巴細(xì)胞分化過程各步驟抗原表達(dá)情況。據(jù)此可準(zhǔn)確確定具有異常表型的淋巴細(xì)胞，這類淋巴細(xì)胞往往是惡性腫瘤細(xì)胞。一個(gè)單一表型淋巴細(xì)胞群體的檢出表明某一淋巴細(xì)胞亞群的單克隆性增生，這是惡性淋巴瘤的特征。何杰金淋巴瘤由于含有大量的非腫瘤成分，免疫表型的分析意義不太大，其研究工作多限于RS細(xì)胞的來源等方面，流式細(xì)胞術(shù)常用于非何杰金淋巴瘤免疫表型分析。如惡性淋巴瘤，小淋巴細(xì)胞型，典型者膜IgM和CD5、CD19、CD20、CD24以及HLA-DR抗原呈陽性表達(dá)；彌漫性惡性淋巴瘤，小核裂和混合細(xì)胞型，免疫表型常表現(xiàn)為CD19、CD20、CD22陽性，有時(shí)CD21和CD24陽性。但通常無CD10的表達(dá)。

隨著不同熒光染料標(biāo)記的多種CD抗體的出現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)已成為淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤免疫表型分析的強(qiáng)有力的工具。

3 T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最重要的一大細(xì)胞群，在免疫應(yīng)答過程中，末梢血T細(xì)胞發(fā)育為功能不同的亞群，在正常機(jī)體內(nèi)，各亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，就可能導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并發(fā)生一系列的病理變化。

目前，越來越多的研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群在各種臨床疾病(如造血系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤等)都有異常改變，在各種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中用不同的T淋巴細(xì)胞表型標(biāo)志物來測定人外周血中T抑制(T8)和T輔助(T4)淋巴細(xì)胞亞群比例T4/T8來評價(jià)體內(nèi)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)平衡狀態(tài)，測定T亞群的相對標(biāo)記率，可以幫助研究各種與免疫有關(guān)的疾病發(fā)病機(jī)制，特別是T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，所以，它可以作為臨床免疫研究的手段，成為臨床檢驗(yàn)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。細(xì)胞免疫功能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)具有一定的關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者免疫功能低下，表現(xiàn)為T4細(xì)胞百分率降低，有甚者出現(xiàn)T4/T8比值倒置的現(xiàn)象，且在復(fù)發(fā)腫瘤患者中也檢測出細(xì)胞免疫功能低下的現(xiàn)象。目前已有較多的不同熒光素(FITC、PE、ECD等)標(biāo)記的CD3、CD4、CD8等抗體，可以應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，從而對免疫功能進(jìn)行評價(jià)。隨著標(biāo)準(zhǔn)參考樣品在流式細(xì)胞術(shù)檢測中的使用，目前流式細(xì)胞術(shù)不僅可以檢測出CD3、CD4、CD8等陽性細(xì)胞占淋巴細(xì)胞中的百分率，而且可以檢測出T抑制(T8)和T輔助(T4)淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)量，為患者免疫功能的評價(jià)提供更加精確的數(shù)據(jù)，指導(dǎo)患者臨床用藥。

4 血小板膜表面受體的標(biāo)記

血小板是巨核細(xì)胞分化成熟后，巨核細(xì)胞質(zhì)裂解脫落的小塊細(xì)胞質(zhì)，它的最表層富含糖蛋白和一些酶，是血小板表面特異吸附的血漿成分，也是血小板黏著、聚集的反應(yīng)部位，血小板膜上含有多種與凝血有關(guān)的因子，在止血、凝血、維持血管內(nèi)皮的完整性方面具有重要的生理功能，血小板數(shù)量和機(jī)能的異常都可以引起釋放反應(yīng)異常及反應(yīng)無力癥，其反應(yīng)異常表現(xiàn)為血小板對ADP、腎上腺素、膠原等誘聚劑的作用形成聚集后，不能釋放ADP及PFs等，如在血小板無力癥患者中血小板膜上的糖蛋白2b-3a復(fù)合物先天缺陷會(huì)導(dǎo)致其血小板聚集功能障礙。

目前認(rèn)為，與血小板有關(guān)的血小板膜受體有2b、3a、2b-3a復(fù)合物，1b、VWF、GMP-140、Fg等，其檢測方法不盡相同，有SDA-PAGE法，交叉免疫電泳法，這種方法難于檢出較低含量的膜受體，而免疫印跡法的靈敏度雖較高，但標(biāo)本用量大，操作復(fù)雜耗時(shí)長，膜純化過程中受體變化大，易丟失等原因，臨床實(shí)驗(yàn)室較少應(yīng)用，放免法易受其他細(xì)胞的干擾或一個(gè)抗原分子結(jié)合多個(gè)抗體而導(dǎo)致測定結(jié)果偏高等缺點(diǎn)，而流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜受體，是分析血小板方法學(xué)上的重要進(jìn)展，它從分子水平診斷血小板功能和數(shù)量的異常，方法操作簡便、快速、特異和準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，且標(biāo)本的用量少，能靈敏地從大量血小板中檢出2%受體陽性或陰性的血小板。因此，流式細(xì)胞術(shù)測定血小板膜受體數(shù)量和功能很適合作為臨床檢驗(yàn)。

近年來，隨著流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是熒光素標(biāo)記的新型抗體的不斷問世，使得流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤免疫學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用，對于腫瘤的早期診斷、判斷預(yù)后、監(jiān)測治療效果等方面具有重要的意義。流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中將具有廣泛的應(yīng)用前景。