趙 玫(綜述)，吳海珍(審校)

(安徽醫(yī)科大學解放軍臨床學院暨105醫(yī)院口腔中心，合肥230032)

近年來，骨組織工程的研究工作主要集中在種子細胞、支架材料、成骨因子和骨的構(gòu)建幾個方面。隨著骨組織工程支架材料的深入研究，納米級羥基磷灰石(nanograde hydroxyapatite，nHAP)作為一種生物陶瓷類材料，以其優(yōu)良的生物學性能受到廣泛的關注，尤其是納米羥基磷灰石復合材料，及其與骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)建工程化骨取得了較大進展。

1 羥基磷灰石與nHAP

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是人體和動物骨骼、牙齒的主要無機成分，具有良好的生物相容性、生物活性、骨傳導性，被認為是一種最具潛力的人體硬組織替換材料。人體內(nèi)天然HAP為65～80 nm的針狀結(jié)晶體，其粒徑位于納米范圍，因此，nHAP與人體的無機成分更加相似，具有更佳的生物性能［1］。

研究表明，nHAP材料可以:①促進成骨細胞黏附［2］。Thian 等［3］用水電動力噴霧法制得 nHAP，體外研究發(fā)現(xiàn)，人成骨細胞在此nHAP材料表面生長速率明顯提高。②促進成骨細胞功能代謝［2］。由于材料表面成骨細胞的聚集和轉(zhuǎn)化因子濃度的提高，促進了成骨細胞增殖、礦化，最終植入材料與周圍組織進行了有效的骨整合。Abd El-Fattah等［4］將nHAP實驗組與 HAP組作對照，nHAP實驗組顯示出更好的成骨能力。

2 nHAP復合支架材料

盡管nHAP作為醫(yī)用生物材料優(yōu)勢明顯，但仍存在脆性大、骨誘導活性差、強度低、力學性能相對較差的問題。為了克服這些弊端，許多學者進行了nHAP復合支架材料研究［5］。nHAP復合材料指在nHAP中加入第二相或者多相材料，進而可以獲得更好的組織學反應、滿意的強度，成為組織再生工程的支架材料。

2.1 膠原 膠原是骨組織的主要成分之一，優(yōu)點有以下幾方面:①來源豐富，它廣泛存在于人和脊椎動物的結(jié)締組織，如皮膚、肌腱、骨和軟骨中。②良好的生物相容性，是人組織細胞外基質(zhì)的主要成分，被普遍認為最不易引起炎癥和抗原反應。③有適合細胞生長的孔徑。但由于膠原也有性能不穩(wěn)定，降解速度難以控制等缺點，所以膠原-nHAP復合材料是目前生物材料研究的熱點。Fukui等［6］將 nHAP-膠原復合材料植入兔下頜骨缺損處，觀察發(fā)現(xiàn)在該復合材料上新骨形成量較大。由于膠原分子結(jié)構(gòu)的不對稱性和大量親水基團的存在，使之具有高度的黏附性和親水性，從而在細胞遷移時能支持和潤滑，還可以誘導產(chǎn)生趨化因子(如血小板生長因子和纖維蛋白等)，從而對細胞的生長具有趨化作用。

2.2 殼聚糖 殼聚糖是自然界中少見的一種帶正電荷的氨基多糖，它的化學名稱為(1-4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖［7］。殼聚糖具有良好的生物降解性和生物相容性，而且無毒、無刺激性殼聚糖和nHAP結(jié)合可以提高細胞黏結(jié)、分化及具有良好的形態(tài)。nHAP/殼聚糖重量之比為70∶30時可以表現(xiàn)出最大的抗壓強度，大約為120 MPa，足以用作承重骨組織的修復。殼聚糖具有良好的生物降解特性，當其作為組織工程支架植入體內(nèi)后，殼聚糖的降解為新骨的生長提供足夠的空間，直至完全被新骨替代，所以nHAP/殼聚糖復合材料植入體內(nèi)后將可以有效地促進骨的修復和重建。在但殼聚糖只能溶于酸性環(huán)境，使得其在醫(yī)學上的應用受到了限制。羧甲基殼聚糖是殼聚糖分子羧甲基化得到的一種水溶性產(chǎn)物，具備殼聚糖所有優(yōu)質(zhì)性質(zhì)，且更利于與其他物質(zhì)結(jié)合，在體內(nèi)可以完全降解。王海斌等［8］采用化學沉淀法合成了nHAP粉體，通過粒子瀝濾法制備羧甲基殼聚糖/nHAP多孔復合材料，測定其材料的孔隙率接近75%，抗壓強度可達21 MPa以上，動物實驗發(fā)現(xiàn)，植入兔骨缺損處未見引起骨組織明顯的炎性反應及骨壞死，肝腎功能檢測未發(fā)現(xiàn)有肝腎毒性，提示該支架材料具有良好的組織相容性和生物安全性。

2.3 聚乳酸和聚酰胺 人工合成的有機物與nHAP復合，可以明顯提高nHAP的力學強度和韌性。聚乳酸種類多種多樣，通常認為聚乳酸對復合材料的影響主要取決于其相對分子質(zhì)量的大小，相對分子質(zhì)量越大，復合材料的力學性能越好［9］，也有研究者認為，隨著nHAP質(zhì)量分數(shù)的增加，nHAP團聚現(xiàn)象越來越嚴重，造成復合支架彎曲模量，壓縮模量出現(xiàn)先增后減的現(xiàn)象［10］。有文獻證明［11］，nHAP 微粒的分散性對復合材料的強度有很大的影響，分散性越好，強度越高。但是聚乳酸與nHAP這兩種材料的性質(zhì)相去甚遠，相容性較差，形成的復合材料界面不穩(wěn)，在熱加工后冷卻時容易在兩相界面間產(chǎn)生裂紋，可以導致力學性能降低［12］，所以目前通常采用耦聯(lián)劑來對nHAP粒子表面進行改性，使得耦聯(lián)劑親水端與nHAP產(chǎn)生作用。

由于聚酰胺分子鏈上含有酰胺鍵，與蛋白骨架結(jié)構(gòu)類似，同時也有很好的力學強度，優(yōu)良的韌性，其剛度也超過了相同分子量的聚乳酸及聚乙烯。動物實驗結(jié)果表明，nHAP/聚酰胺復合材料具有優(yōu)異的生物活性和力學性能，與自然骨能形成牢固的生物性的骨鍵合［13］。另外，還發(fā)現(xiàn)該種材料具有誘導軟骨的特性。Xu等［14］合成的三維多孔nHAP/PA66支架，實驗測試該支架具有顯著的組織相容性和骨誘導性，被認為是有潛力的骨替代材料。

2.4 多相復合物 目前對nHAP支架材料的研究熱點不僅僅局限于單純與天然或者人工合成材料二相復合，而在改性的三相和多相的復合支架研究方面業(yè)已引起人們的重視。Niu等［15］在制備殼聚糖微球和羥基磷灰石膠原(nanohydr-oyapatita/collagen，nHAC)的基礎上，又加入聚乳酸合成出殼聚糖微球/nHAC/P-LLA，實驗中以nHAC/聚乳酸為對照組來修復兔股骨6 mm的缺損。體外測試表明，實驗組有更好的形態(tài)和骨增殖能力，體內(nèi)實驗在4、8、12周形態(tài)學和組織學觀察，實驗組更好地加速了松質(zhì)骨缺損再生的能力。Huang等［16］用殼聚糖來改性nHAP/PA66，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該改性支架材料的壓縮模量和壓縮強度都較對照組增強了5～6倍。

3 nHAP支架材料與骨形成蛋白

骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一種存在于骨基質(zhì)中的二聚物分子，為一種疏水性酸蛋白，其主要的生物學作用是誘導間充質(zhì)細胞分化形成軟骨和骨，其作用沒有種屬特異性，具有跨種誘導成骨的性能。此外，BMP還具有刺激新生血管形成的能力［17］。在BMP家族中，BMP-2的骨誘導活性強，是研究較多的骨組織工程中的骨生長因子。BMP單獨使用半衰期很短，在體內(nèi)擴散很快，易被中性蛋白酶分解，因而不能在有效的時間內(nèi)作用于更多的靶細胞，其活性難以得到充分發(fā)揮，而且由于缺乏骨細胞生長所需的三維空間結(jié)構(gòu)，新骨生成量少。當nHAP和BMP-2與適當?shù)妮d體復合后能阻止BMP-2的迅速降解，使其在骨修復中持續(xù)發(fā)揮誘導作用，成骨效果可以放大許多倍。Iton等［18］通過放射學和組織學觀察后顯示，nHAP-膠原復合材料吸附重組人 BMP2(recombinant human BMP2，rhBMP2)后可刺激動物脛骨缺損處的新骨形成，可誘導骨重建。Liu 等［19］以5∶1(v/w)的比例將膠原和nHAP 合成，再和膠原纖維蛋白、rhBMP2采用凍干技術(shù)合成了rhBMP2/明膠/nHAP/纖維蛋白的支架材料。免疫組化顯示，rhBMP2的釋放可以提高骨鈣素堿性磷酸酶的表達和鈣沉積的形成，且支架無毒性。通過大體標本和X線，及骨組織形態(tài)學和骨密度檢測均顯示良好的成骨能力，12周后可完全修復節(jié)段性兔骨缺損。

4 nHAP支架材料與骨髓間充質(zhì)干細胞

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因自身獨特優(yōu)勢成為骨組織工程中理想的種子細胞。已有研究表明［20-21］，BMSCs在支架材料內(nèi)黏附生長、增殖分化，分泌出含有骨源性生長因子(BMP、轉(zhuǎn)化生長因子β等)的基質(zhì)，誘導成骨細胞或者軟骨細胞分化，以促進更多的新骨在支架材料周圍和內(nèi)部形成，從而實現(xiàn)組織工程化骨。以BMSCs作為目標細胞與支架材料復合培養(yǎng)，成為研究熱點。張凱等［22］采用 nHA 的孔徑為100～250 μm，孔隙率為90%，直徑和厚度為5 mm的圓片狀支架材料，觀察兔BMSCs與支架材料的生物相容性。復合培養(yǎng)3 d后堿性磷酸酶活性增強，5 d后細胞數(shù)目明顯增加，說明nHAP具有良好的組織相容性，同時材料孔隙及其表面物質(zhì)為BMSCs的黏附增殖分化提供了非常有利的條件。Phipps等［23］證實，BMSCs在聚己酸內(nèi)酯/膠原/nHAP三維支架材料中黏附增殖能力強，并且對該材料進行了力學實驗，表明它具有良好的力學性能。實驗者認為該支架材料的這些優(yōu)點，是因為其同時具備了聚己酸內(nèi)酯的機械性能和膠原、HAP的天然生化性能。戚孟春等［24］用密度梯度離心法分離出兔BMSCs，與制備好的nHA/PA66支架材料復合培養(yǎng)，將單獨BMSCs和加入了骨相誘導液的組作為對照，掃描電鏡觀察下表明支架材料適合于細胞附著，細胞生長旺盛細胞間有廣泛的細胞突起連接。研究證實，nHA/PA66適于BMSCs黏附生長及骨向分化，是一種性能優(yōu)良的骨組織工程支架材料，具有很高的應用價值。

5 骨組織工程nHAP材料的生物學評價

隨著納米材料在骨缺損中應用越來越廣泛，納米材料的毒性效應也日益受到人們的高度關注。納米材料的尺寸很微小，當小顆粒尺寸進入納米級時，其特性與大塊材料有明顯的區(qū)別，一些原本無毒或者具有輕微毒性的顆粒達到納米級時毒性明顯增強。對于植入性生物材料，因其會在體內(nèi)存留時間較長，所以材料的安全性如何，是否對人體有危害，是值得嚴肅關注的問題。一種醫(yī)用材料在植入生物體或者臨床應用之前，必須按照國家有關標準對其進行生物安全性評價。

參照國際標準化組織(ISO)發(fā)布的醫(yī)療器械和生物材料生物學評價試驗指南ISO10993(GB/T16886)和我國衛(wèi)生部制定的生物材料和醫(yī)療器械生物學評價標準1997，制定了從細胞水平到整體動物的較完整的評價框架，采用體外細胞毒性實驗、溶血實驗、致敏實驗、急性毒性實驗、熱原實驗以及遺傳毒性實驗來初步評價nHAP復合材料的生物安全性，從而為臨床應用提供科學依據(jù)。

研究nHAP材料對細胞毒性作用，第一步要解決的問題是明確該材料對細胞的作用。最常用的一類方法是通過細胞存活率判斷細胞毒性大小，其中3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法(MTT)是目前納米材料細胞毒性檢測中最常用的方法。代震宇等［25］將 nHAP/聚氨基酸復合材料按照ISO10993-1標準規(guī)定進行實驗，結(jié)果顯示體外細胞毒性實驗觀察材料對細胞形態(tài)與生長無明顯影響，MTT檢測實驗組細胞毒性為1級，全身急性毒性實驗顯示實驗組動物無中毒及死亡，致敏實驗顯示無水腫及紅斑，溶血實驗符合實驗標準，認為該材料具有良好生物安全性。李鴻等［26］用注塑方法，以nHAP/PA66復合材料為原料，使用專用的發(fā)泡劑，制備出了一種平均孔隙尺寸為500 μm、孔隙率為75%的多孔支架，并對其進行了生物安全評價實驗，結(jié)果表明該材料具有良好的生物安全性，可用于骨組織修復。湯京龍等［27］在對nHAP做急性毒性實驗后發(fā)現(xiàn)，nHAP在存在一定的團聚的情況下，容易引起血管栓塞導致動物死亡，并且實驗結(jié)果說明充分分散的nHAP在進入血液循環(huán)后有可能潛移到體內(nèi)其他器官中。

由于nHAP復合材料本身在骨缺損修復中的優(yōu)越性，使得針對此類材料的研究更加完善，并且可以作為BMSc和BMP-2的載體材料?？墒且廊淮嬖诤芏鄦栴}需要繼續(xù)研究解決，比如，如何改善合成方法來提高材料的強度性能，如何進一步完善和測定此類材料的生物安全性等。當然，目前國內(nèi)外對nHAP復合材料的研究都主要集中在實驗室階段，與臨床使用還具有很大的距離。因此，nHAP的發(fā)展與應用在具有良好前景的同時也面臨諸多挑戰(zhàn)。

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