張智慧，郭 陽(yáng)綜述，胡偉平審校

0 引 言

干細(xì)胞根據(jù)其來(lái)源不同，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞具有自我更新能力，在一定條件下能分化成特定的組織，又可實(shí)現(xiàn)跨胚層分化發(fā)育，即分化成在發(fā)育上與其無(wú)關(guān)的其他組織的細(xì)胞類(lèi)型，稱(chēng)為可塑性或橫向分化［1］。Gronthos等［2］研究發(fā)現(xiàn)，人牙髓組織中存在一類(lèi)未分化前體細(xì)胞，它們可終末分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，并分泌細(xì)胞基質(zhì)。將其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells，BMSC)進(jìn)行對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，它們同樣具有成體干細(xì)胞橫向分化的潛能，并將其命名為DPSC。本文就外胚層來(lái)源的DPSC分化研究進(jìn)展做一綜述。

1 DPSC多向分化

1.1 向外胚層細(xì)胞分化

1.1.1 向神經(jīng)細(xì)胞分化 Agens等［3］第 1周用20 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、40 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，第 2、3 周分別加入40 ng/ml FGF 和 0.5 μmol/L 全反氏維甲酸，體外誘導(dǎo)成人DPSC后均出現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)，實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化檢測(cè)到早期神經(jīng)表面標(biāo)記巢蛋白(nestin)、微管蛋白Ⅲ(tubulin-Ⅲ)和成熟神經(jīng)表面標(biāo)記NF-M、NF-H在基因和蛋白水平的表達(dá)。電生理學(xué)檢測(cè)到Na+通道系統(tǒng)有8.5倍的內(nèi)向電流增加，這與Biella等［4］研究結(jié)果一致，Na+通道系統(tǒng)的變化與神經(jīng)干細(xì)胞的分化產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力有關(guān)，電壓依賴(lài)性Na+電流被用于電標(biāo)記評(píng)估成熟的神經(jīng)元分化。

1.1.2 向角膜上皮細(xì)胞方向分化 角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cell，LSC)位于角膜和鞏膜之間過(guò)渡的區(qū)域，在眼表面損傷時(shí)，能促進(jìn)角膜上皮的不斷更新和再生，甚至重建整個(gè)角膜上皮，它具有高度特異性，但數(shù)量十分有限。Monteiro等［5］用免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人未成熟DPSC(hIDPSC)表達(dá)LSC特異性標(biāo)記波形蛋白、整合素β1、和p63、連接蛋白43，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)K3/12弱陽(yáng)性表達(dá)，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hIDPSC與LSC一樣出現(xiàn)間隙連接蛋白43及K12的表達(dá)。他們的研究結(jié)果顯示，hIDPSC移入體內(nèi)能分化成角膜上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞能使角膜恢復(fù)清晰、平滑，整個(gè)角膜表面完全由移殖的hIDPSC組成。移植后第2周，角膜開(kāi)始透明，到3個(gè)月逐步改善，此時(shí)HE染色研究表明，能形成類(lèi)似正常的角膜上皮細(xì)胞，由此得出hIDPSC有能力分化為角膜上皮的結(jié)論。

1.2 向中胚層細(xì)胞分化

1.2.1 向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化 Iohara等［6］發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在體外誘導(dǎo)DPSC，使其形態(tài)明顯改變，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性顯著提高，成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性的表型標(biāo)記牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)呈陽(yáng)性表達(dá)。Nakashima等［7］用電穿孔法將生長(zhǎng)/分化因子-11基因?qū)隓PSC使其分化，形成牙本質(zhì)細(xì)胞樣外觀，并出現(xiàn)類(lèi)似牙本質(zhì)的修復(fù)。About等［8］發(fā)現(xiàn)，L-抗壞血酸、地塞米松、無(wú)機(jī)磷酸鹽、維生素C和2-磷酸甘油鈉可誘導(dǎo)DPSC產(chǎn)生牙本質(zhì)樣的礦化基質(zhì)。

1.2.2 向成骨細(xì)胞分化 骨組織工程包括種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子等［9］。Pierdomenico 等［10］發(fā)現(xiàn)第3代人DPSC同BMSC一樣，10 mmol/L β-甘油酸鈉、0.2 mmol/L 抗壞血酸、10－8mmol/L 地塞米松誘導(dǎo)3～4周后，Von Kossa染色見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)形成和ALP活性增強(qiáng)，顯示了向成骨方向分化的特點(diǎn)。Wu等［11］的研究表明，毛囊真皮乳頭干細(xì)胞與DPSC一樣能實(shí)現(xiàn)成骨分化。Mendona等［12］在4個(gè)月的雄性NIS大鼠的顱頂區(qū)域制造5mm×8mm缺陷，左側(cè)缺損處只提供膠原膜，右邊提供膠原膜和hIDPSC，2個(gè)月后，右邊區(qū)域處形成的骨質(zhì)更成熟和致密，DPSC已用于骨組織工程種子細(xì)胞。

1.2.3 向軟骨細(xì)胞分化 Zhang等［13］培養(yǎng)來(lái)自衛(wèi)生研究所最初的牙髓細(xì)胞系［2］DPSC-NIH和凍存第3磨牙的25代DPSC，用5mmol/L的磷酸二氫鉀、50 μg/ml的L-抗壞血酸和50 μg/ml慶大霉素等分別誘導(dǎo)3周后，發(fā)現(xiàn)兩者形成的4個(gè)顆粒具有相似的表型，對(duì)顆粒中的細(xì)胞行組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人DPSCNIH形成的顆粒含有更多的細(xì)胞，中間的細(xì)胞大多呈圓形，由豐富的細(xì)胞外基質(zhì)分隔，外圍由一些紡錘形的細(xì)胞層形成。軟骨細(xì)胞譜系阿爾辛藍(lán)染色表明，兩者形成結(jié)構(gòu)中均有硫酸糖胺的高表達(dá)和Ⅱ型膠原，這種結(jié)構(gòu)接近骨髓干細(xì)胞向軟骨誘導(dǎo)分化形成的軟骨結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，軟骨細(xì)胞移植取得了可喜的成績(jī)，但修復(fù)的軟骨組織內(nèi)細(xì)胞分子學(xué)特性尚未完全清楚［14］。DPSC向軟骨細(xì)胞分化的深入研究有助于損傷修復(fù)特性的研究。

1.2.4 向脂肪細(xì)胞分化 Gronthos等［15］發(fā)現(xiàn)，潑尼松、0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤、0.5 μmol/L氫化可的松，60 μmol/L消炎痛誘導(dǎo)DPSC 5周后，出現(xiàn)了油紅O染色陽(yáng)性的脂滴，利用RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子即過(guò)氧化物酶增生激活受體(peroxidase proliferator-activated recepiot γ2，PPARγ2)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)基因的表達(dá)。有學(xué)者用0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、1 mmol/L地塞米松、10 mmol/L胰島素、200 mmol/L吲哚美新、50mg/ml慶大霉素誘導(dǎo)人DPSC，免疫組化檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(glucose transporter 4，GLUT-4)，RT-PCR檢測(cè)特異性標(biāo)記 PPARγ2和GLUT-4的表達(dá)［13］，進(jìn)一步證明 DPSC能向脂肪細(xì)胞分化。

1.2.5 向肌細(xì)胞分化 Laino等［16］研究證明，來(lái)自于脫落牙齒的CD34+/STRO－1+細(xì)胞，即DPSC與鼠肌C2C12細(xì)胞共同培養(yǎng)在嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基中，可觀察到肌管融合，進(jìn)一步證明在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，DPSC可向肌源性細(xì)胞分化。Zhang等［13］發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L地塞米松、50 mmol/L氫化可的松、50 mg/ml慶大霉素可誘導(dǎo)DPSC出現(xiàn)成肌細(xì)胞早期標(biāo)記生肌因子(myogenin，MyoD1)與后期標(biāo)記主要組織相容性復(fù)合體(major histocompati-bility compler，MHC)的陽(yáng)性表達(dá)，為DPSC的成肌分化研究提供更深入可靠的依據(jù)。

1.3 向內(nèi)胚層細(xì)胞分化 Fonseca等［17］將人DPSC(46，XY)注射至5～8周的CD-1鼠的囊胚里，DPSC可以生存、增殖，形成滋養(yǎng)層細(xì)胞，分化為不同的細(xì)胞類(lèi)型。當(dāng)移植至培養(yǎng)老鼠的子宮中，這些囊胚可進(jìn)行胚胎發(fā)生的過(guò)程，并形成人/鼠嵌合體，同時(shí)也保留人DPSC分化的特點(diǎn)，形成人體多種器官的細(xì)胞表現(xiàn)，例如腦、肝、腸和心臟。免疫熒光檢測(cè)鼠胚胎的各部分，隨著熒光的減少，抗hIDPSC抗體在腦、肝、腸和肌肉的嵌合體內(nèi)出現(xiàn)高表達(dá)。肝和腸在胚胎來(lái)源上屬內(nèi)胚層，可認(rèn)為hIDPSC在適當(dāng)?shù)臈l件下有向內(nèi)胚層細(xì)胞分化的潛力。

2 DPSC分化的研究進(jìn)展

2.1 分化方法 目前，對(duì)成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法主要分:①化學(xué)試劑(二甲基亞砜等)誘導(dǎo)，Lu等［18］認(rèn)為，該法會(huì)使細(xì)胞出現(xiàn)毒性改變。②基因轉(zhuǎn)染或修飾，但在真核細(xì)胞中表達(dá)率低、穩(wěn)定性差。③細(xì)胞或組織共培養(yǎng)，但誘導(dǎo)條件控制相對(duì)困難。④細(xì)胞因子誘導(dǎo)。目前主要依靠 bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growht factor-β，TGF-β)、EGF 等，bFGF是一種具有廣譜作用的多肽因子，可直接作用于其靶細(xì)胞(和血管內(nèi)皮細(xì)胞等)上特異性受體，并通過(guò)促分裂效應(yīng)使這些細(xì)胞發(fā)生分裂增殖，促進(jìn)細(xì)胞增生［19］。研究表明，bFGF和 TGF-β聯(lián)合作用，促DPSC向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化作用顯著增強(qiáng)［20］。細(xì)胞因子誘導(dǎo)可部分模擬體內(nèi)環(huán)境，但各種因子的組合、時(shí)間、先后順序的選擇仍是DPSC分化需深入研究。

2.2 分化機(jī)制 關(guān)于成體干細(xì)胞可塑性的機(jī)制尚不十分明確，主要包括以下幾種［21］:干細(xì)胞來(lái)源機(jī)制、去分化機(jī)制、細(xì)胞融合機(jī)制、一種組織中同時(shí)含有其他組織特定的細(xì)胞成分。Vassilopoulos等［22］通過(guò)對(duì)BMSCs的研究認(rèn)為，成體組織干細(xì)胞橫向分化是由于細(xì)胞自發(fā)融合。Tran等［23］對(duì)接受男性骨髓CD34+細(xì)胞移植的5例女性患者口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行了分析，提出細(xì)胞間的自發(fā)融合可能只是偶發(fā)事件，因此，橫向分化現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制尚無(wú)定論。對(duì)DPSC與BMSC的分化能力研究有助于尋找干細(xì)胞的共同特點(diǎn)及性質(zhì)，另外，牙髓組織來(lái)源廣泛［6］，體積較小，隨著誘導(dǎo)條件不斷改進(jìn)，研究人員終將會(huì)采用有效的方法獲得足量的DPSC，并最終擴(kuò)增出高效的分化細(xì)胞，逐漸解決種子細(xì)胞少、純度低等問(wèn)題，為分化機(jī)制的研究提供足夠的成體干細(xì)胞來(lái)源。

2.3 表面標(biāo)記 最近，Kerkis等［24］發(fā)現(xiàn)，DPSC能表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記(SH2、SH3和SH4)和人類(lèi)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記((OCT-4、SSEA-3和SSEA-4)。牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)與牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)被認(rèn)為是牙本質(zhì)特異性蛋白，目前已證實(shí) DSP、DPP是由單一基因編碼的，被稱(chēng)為DSPP，是 DSP與 DPP的基因復(fù)合體，它們來(lái)源于同一轉(zhuǎn)錄本，DSPP可作為檢測(cè)成牙本質(zhì)細(xì)胞活性的生化指標(biāo)［25］。但有報(bào)道DSPP在骨組織中也有少量表達(dá)［15］。Liu 等［26］發(fā)現(xiàn)，在 DPSC 向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)，初始 Runx2、TGF-β相關(guān)基因、膠原代謝相關(guān)基因上調(diào)，ALP活性上升后均下降，而細(xì)胞外基質(zhì)磷糖蛋白(matrix extracellular phosphogly coprotein，MEPE)是DPSC分化過(guò)程中唯一下降的標(biāo)記物，故認(rèn)為MEPE是礦化的抑制劑，在DPSC分化時(shí)下調(diào)，MEPE可作為分化的標(biāo)記物。目前，DPSC表面特異性標(biāo)記及分化后鑒定仍不完全明確，只有把這些問(wèn)題解決，才能從細(xì)胞和分子水平上更深入的認(rèn)識(shí)成體干細(xì)胞。

3 DPSC分化的應(yīng)用及展望

3.1 牙齒及骨組織疾病的治療 DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨分化，具有治療牙體牙髓疾病、再生牙齒和骨組織修復(fù)的潛力。有學(xué)者誘導(dǎo)DPSC形成修復(fù)性牙本質(zhì)保護(hù)暴露的牙髓，進(jìn)行蓋髓治療［27］。目前，Perry等［28］正致力于利用實(shí)驗(yàn)室超低溫保存DPSC進(jìn)行牙齒再生的研究，一旦運(yùn)用臨床，則可能提高損傷牙體組織的生物活性，利于牙髓疾病愈合和組織再生。有學(xué)者證明，在適當(dāng)?shù)臈l件下，hIDPSC可進(jìn)行成骨分化，并在動(dòng)物手術(shù)60 d后顱骨缺損明顯治愈［12］。DPSC有望作為種子細(xì)胞，恢復(fù)牙齒及骨組織的形態(tài)與功能將會(huì)進(jìn)入一個(gè)全新的時(shí)代。

3.2 其他系統(tǒng)疾病的治療 Huang等［29］培養(yǎng)恒河猴的DPSC發(fā)現(xiàn)其具有分化能力，將其植入實(shí)驗(yàn)鼠大腦中的海馬區(qū)，發(fā)現(xiàn)其可以刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)。Agens等［3］將誘導(dǎo)后的DPSC移入胚胎發(fā)生2d的雞胚中，腦熒光跟蹤發(fā)現(xiàn)神經(jīng)形態(tài)學(xué)特征，并表達(dá)特異性標(biāo)記，說(shuō)明DPSC可提供一個(gè)易得的干細(xì)胞來(lái)源，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中有巨大的潛力。Monteiro等［5］也證明，DPSC可作為L(zhǎng)SC替代來(lái)源，用于角膜重建，是角膜干細(xì)胞缺陷患者的巨大希望。以上DPSC體內(nèi)移植后的細(xì)胞壽命需要進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行觀察，回植入人體內(nèi)，時(shí)機(jī)、部位、數(shù)量等尚待探究。隨著研究的深入，DPSC的分化也將有望應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、軟骨損傷、肌肉損傷及心臟的修復(fù)等機(jī)體多種組織器官損傷的修復(fù)治療［30］。

［1］Sata M，Saiura A，Kunisato A，et al.Hematopo ietic stem cells differentiate into vascular cells t hat participate in t he pat hogenesis of at herosclerosis［J］.Nature Med，2002，8(4):403-409.

［2］Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(25):13625-13630.

［3］Agens A，Grigori R，Songtao S，et al.Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues［J］.Stem Cells，2008，26(7):1787-1795.

［4］Biella G，di Febo F，Goffredo D，et al.Differentiating embryonic stemderived neural stem cells show a maturation-dependent pattern of voltage-gated sodium current expression and graded action potentials［J］.Neuroscience，2007，149(1):38-52.

［5］Monteiro BG，Seraim RC，Melo GB.Human immature dental pulp stem cells share key characteristic features with limbal stem cells［J］.Cell Prolif，2009，42(5):587-594.

［6］Iohara K，Zheng L，Ito M，et al.Side population cells isolated from porcine dental pulp tissue with self-renewal and multipotency for dentinogenesis，chondrogenesis，adipogenesis，and neurogenesis［J］.Stem Cells，2006，24(11):2493-2503.

［7］Nakashima M，Iohara K，Ishikawa M，et al.Stimulation of reparative dentin formation by ex vivo gene therapy using dental pulp stem cells electrotransfected with growth/differentiation factor11(Gdf11)［J］.Hum Gene Ther，2004，15(11):1045-1053.

［8］About I，BotteroMJ，de Denato P，et al.Human dentin production in vitro［J］.Exp Cell Res，2000，258(1):33-41.

［9］張森林，毛天球.生物可降解的骨組織工程支架材料的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21(10):1098-1100.

［10］Pierdomenico L，Bonsi L，Calvitti M，et al.Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp［J］.Transplantation，2005，80(6):836-842.

［11］Wu G，Deng Z，F(xiàn)an X，et al.Odontogenic potential of mesenchymal cells from hair follicle dermal papilla［J］.Stem Cells Development，2009，18(4):583-589.

［12］Mendona CA，Bueno DF，Martins MT，et al.Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells［J］.Craniofac Surg，2008，19(1):204-210.

［13］Zhang W，Walboomers F，Shi S，et al.Multilineage differentiation potential of stem cells derived from human dental pulp after cryopreservation［J］.Tissue Eng，2006，12(10):2813-2823.

［14］徐楊俊，趙建寧.關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23(8):889-894.

［15］Gronthos S，Brahim J，Li W，et al.Stem cell propertiesof human dental pulp stem cells［J］.J Dent Res，2002，81(8):531-535.

［16］Laino G，Graziano A，d'Aquino R，et al.An approachable human adult stem cell source for hard-tissue engineering［J］.Cell Physiol，2006，206(3):693-701.

［17］Fonseca SA，Abdelmassih S，Lavagnolli T，et al.Human immature dental pulp stem cells'contribution to developing mouse embryos:Production of human/mouse preterm chimaeras［J］.Cell Proliferation，2009，42(2):132-140.

［18］Lu P，Blesch A，Tuszynski MH.Induction of bone marrow stromal cells to neurons:Differentiation，transdifferentiation or artifact［J］.Neurosci Res，2004，77(2):174-191.

［19］蔡 輝，趙智明，修春英.丹參酮ⅡA對(duì)溶血磷酯酸致新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖及分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21(2):126-128.

［20］He HX，Yu JH，Liu Y，et al.Effects of FGF2 and TGFb1 on the differentiation of human dental pulp stem cells in vitro［J］.Cell Biol Inte，2008，32(7):827-834.

［21］Verfaillie CM.Adult stem cells:Assessing the case for pluripotency［J］.Trends Cell Biol，2002，12(11):502-508.

［22］Vassilopoulos G，Wang PR，Russell DW.Transp lanted bone marrow regenerates liver by cell fusion［J］.Nature，2003，422(6934):901-904.

［23］Tran SD，Pillemer SR，Dutra A，et al.Differentiation of human bone marrow derived cells into buccal epithelial cells in vivo:A molecular analytical study［J］.Lancet，2003，361(9363):1084-1088.

［24］Kerkis I，Kerkis A，Dozortsev D，et al.Isolation and characterizationof a population of immature dental pulp stem cells expressing Oct-4and other embryonic stem cell markers［J］.Cells Tissues Organs，2006，184(34):105-116.

［25］Dsouza RN，Bronckers AL，Happonen RP.Developmental expression of a 53 KD dentin sialoprotein in rat tooth organs［J］.J Histochem Cytochem，1992，40(3):359-366.

［26］Liu H，Li W，Gao C，et al.Dentonin，a fragment of MEPE，enhanced dental pulp stem cell proliferation［J］.J Dent Res，2004，83(6):496-499.

［27］Keklikoglu N.The localization of Fos B，a member of transcription factor AP21 family，in rat odontoblast s and pulpal undifferentiated ectomesenchymal cells［J］.Folia Histochem Cytobiol，2004，42(3):191-193.

［28］Perry BC，Zhou D，Wu X，et al.Collection，cryopreservation，and characterization of human dental pulpderived mesenchymal stem cells for banking and clinical use［J］.Tissue Eng，2008，14(2):149-156.

［29］Huang AH，Snyder BR，Cheng PH，et al.Putative dental pulpderived stem/stromal cells promote proliferation and differentiation of endogenous neural cells in the hippocampus of mice［J］.Stem Cells，2008，26(10):2654-2663.

［30］譚 謙.再生醫(yī)學(xué)與組織工程［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24(2):113-116.