劉晉輝 何吉 陳舒 秦斐 王芳 徐罡 朱發(fā)明 呂杭軍 嚴(yán)力行

造血干細(xì)胞移植是治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、實(shí)體瘤、免疫缺陷病、遺傳性疾病的有效手段。近年來臍血造血干細(xì)胞因其來源廣泛、HLA配合程度要求低、患者移植后移植物抗宿主病發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床造血干細(xì)胞移植中。評價(jià)臍血造血干細(xì)胞質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)是集落培養(yǎng)效果［1］，但是目前國內(nèi)臍血造血干細(xì)胞庫所采用的各種培養(yǎng)體系在集落培養(yǎng)效果方面存在差異［2］。我們對比分析了臍血造血干細(xì)胞庫常用的H4534和GF-H4434兩種甲基纖維素培養(yǎng)基生成細(xì)胞集落的能力，以期為臍血造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臍血來源

選擇2009年1月至2011年1月足月分娩的565名產(chǎn)婦作為志愿者。在志愿者知情同意下，用三聯(lián)采血袋從其臍靜脈采集臍血。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(HEPA class 100，Thermo，美國)，倒置相差顯微鏡(TE2000-U，NIKON，日本)，臺式離心機(jī)(MACH 1.6，SORVALL，美國)。

RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco?，美國)，淋巴細(xì)胞分離液(1.077 g/mL，上海華精生物高科技有限公司)，H4534甲基纖維素培養(yǎng)基(MethoCult?，加拿大)和GF-H4434甲基纖維素培養(yǎng)基(MethoCult?，加拿大)。GF-H4434系在H4534基礎(chǔ)上添加促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制備

采用兩步法獲得濃縮的造血干細(xì)胞［3］。用3 mL RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌轉(zhuǎn)移袋中臍血干細(xì)胞，加至4 mL淋巴細(xì)胞分離液表面，以800 g離心20 min，吸取白膜層，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106/L備測。

1.3.2 集落培養(yǎng)

根據(jù)不同培養(yǎng)條件分為H4534組(n=251)和GF-H4434組(n=314)。H4534組采用H4534甲基纖維素培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含1.0%甲基纖維素、30%FBS、1% 牛血清蛋白、10 μmol 2-巰基乙醇、2 mol L-谷氨酰胺、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和50 ng/mL干細(xì)胞因子，可生成含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(granulocytemacrophage colony forming unit，CFU-GM)、巨噬細(xì)胞集落形成單位(macrophage colony forming unit，CFU-M)和粒細(xì)胞集落形成單位(granulocyte colony forming unit，CFU-G)的細(xì)胞集落。GF-H4434組為GF-H4434甲基纖維素培養(yǎng)基，其培養(yǎng)體系成分在H4534體系的基礎(chǔ)上增加3 U/mL EPO，可生成含有CFU-GM、紅細(xì)胞爆裂型集落形成單位(erythrocytic burst-forming unit，BFU-E)和粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-單核細(xì)胞集落形成單位(granulocyte-erythrocyte-macrophage-monocyte colony forming unit，CFU-GEMM)的細(xì)胞集落。

將100μL臍血干細(xì)胞分別加入0.9 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后加入六孔培養(yǎng)板，37℃、5%二氧化碳飽和濕度條件下培養(yǎng)14～16 d。

1.3.3 觀察指標(biāo)

培養(yǎng)后將六孔板放于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況、形態(tài)學(xué)特征，并計(jì)數(shù)各種集落數(shù)，以含40個(gè)細(xì)胞及以上的細(xì)胞團(tuán)為1個(gè)集落，記錄每個(gè)臍血培養(yǎng)皿中的各類集落數(shù)量。因CFU-M和CFU-G集落為CFU-GM的同一類集落，觀察結(jié)果時(shí)以CFU-GM統(tǒng)一計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件包。數(shù)據(jù)分析用u檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組樣本中CD34+細(xì)胞百分率和有核細(xì)胞總數(shù)比較

兩組樣本中CD34+細(xì)胞百分率和有核細(xì)胞總數(shù)檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組標(biāo)本中CD34+細(xì)胞百分率和有核細(xì)胞總數(shù)檢測結(jié)果比較±s)

表1 兩組標(biāo)本中CD34+細(xì)胞百分率和有核細(xì)胞總數(shù)檢測結(jié)果比較±s)

組別 份數(shù) CD34+細(xì)胞百分率(%)有核細(xì)胞總數(shù)(×108)H4534組251 0.384±0.178 11.92±3.07 GF-H4434組 314 0.421±0.215 11.39±2.62 u值2.27 2.20 P值 ＞0.05 ＞0.05

2.2 兩組樣本培養(yǎng)后集落形成比較

H4534組培養(yǎng)后觀察到 CFU-GM、CFU-M和CFU-G細(xì)胞集落，集落特征見圖1。GF-H4434組培養(yǎng)后觀察到CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM細(xì)胞集落，集落特征見圖2。

H4534組CFU-GM集落數(shù)為(55.71±28.24)/105;GF-H4434組CFU-GM集落數(shù)為(66.28±31.99)/105，BFU-E 集落數(shù)為(64.89 ±34.95)/105，CFU-GEMM集落數(shù)為(2.53±2.08)/105。兩組CFU-GM集落數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=4.16，P＜0.05)，提示GF-H4434培養(yǎng)基更利于CFU-GM形成。

圖1 臍血在H4534培養(yǎng)基中形成的集落特征

圖2 臍血在GF-H4434培養(yǎng)基中形成的集落特征(×40)

3 討論

臍血的質(zhì)量是確保臍血移植安全的重要因素，臍血復(fù)蘇后需要達(dá)到較高的有核細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性及無病原體感染、無潛在遺傳疾病要求，以便為臍血移植成功和提高受者存活率奠定良好的基礎(chǔ)。目前臨床評價(jià)臍血質(zhì)量的指標(biāo)主要有HLA匹配程度、有核細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞數(shù)量以及CFU-GM集落數(shù)量，這些指標(biāo)是決定臍血移植后受者造血和免疫重建成功與否的重要因素。

體外半固體細(xì)胞培養(yǎng)集落形成單位是評價(jià)造血前體細(xì)胞增殖分化能力的重要指標(biāo)，在適宜的細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，不同的定向祖細(xì)胞可產(chǎn)生相應(yīng)的集落，如 CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM 等。CFU-GM 數(shù)量能夠較好反映臍血造血干細(xì)胞的增殖分化能力，與造血重建的快慢和植入率［4］有關(guān)，但是目前國內(nèi)外臍血造血干細(xì)胞庫報(bào)道的臍血造血干細(xì)胞中CFU-GM的數(shù)量差異較大，其原因可能是選擇的培養(yǎng)體系、操作方法存在不同之故［5-9］。由于H4534和GF-H4434這兩種培養(yǎng)基都為商品化試劑盒，且試劑各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)過嚴(yán)格的驗(yàn)證，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室具有可比性;目前，該兩種試劑為國內(nèi)外許多臍血庫所采用，因此我們選擇了H4534和GF-H4434兩種培養(yǎng)體系做比較，觀察CFU-GM集落數(shù)形成的差異，以期為不同的臍血庫選擇培養(yǎng)基時(shí)提供參考。

臍血中CD34+細(xì)胞數(shù)與CFU-GM集落數(shù)量有明顯的相關(guān)性［10］，本研究為了排除兩組樣本因CD34+細(xì)胞含量不同導(dǎo)致的培養(yǎng)后集落數(shù)量的差異，我們檢測分析了兩組臍血中CD34+細(xì)胞和有核細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果兩組間CD34+細(xì)胞百分率和有核細(xì)胞總數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示添加了EPO的GF-H4434培養(yǎng)基比H4534培養(yǎng)基產(chǎn)生CFU-GM的數(shù)量更多，提示兩種培養(yǎng)體系下產(chǎn)生的CFU-GM集落數(shù)差異主要由于培養(yǎng)體系不同而致。

EPO是造血分化中的主要刺激因子，能促進(jìn)造血干細(xì)胞向原始紅細(xì)胞分化，加速幼紅細(xì)胞的分裂、增殖，促進(jìn)血紅蛋白的合成和紅細(xì)胞誘導(dǎo)分化。GF-H4434培養(yǎng)體系中除CFU-GM集落外還產(chǎn)生了BFU-E和CFU-GEMM等細(xì)胞集落。CFU-GM是粒單細(xì)胞集落形成單位，其數(shù)量多少反應(yīng)了造血重建時(shí)粒單細(xì)胞形成能力，這關(guān)系著移植后中性粒細(xì)胞的植入效果。BFU-E是紅細(xì)胞系造血祖細(xì)胞，其數(shù)量反應(yīng)了紅細(xì)胞系造血恢復(fù)的能力。CFU-GEMM具多系分化能力，包括向紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系、粒細(xì)胞系方向分化等，其數(shù)量多少反應(yīng)了造血干細(xì)胞的多細(xì)胞系分化能力。這可能是EPO在刺激干細(xì)胞向紅細(xì)胞系細(xì)胞分化的過程中與其他細(xì)胞因子相互作用的結(jié)果。EPO作用于造血前體細(xì)胞的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是多個(gè)通路交聯(lián)、互補(bǔ)、形成網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜傳導(dǎo)過程［11］，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GF-H4434培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血產(chǎn)生的CFU-GM較多，而且能產(chǎn)生如 BFU-E和CFU-GEMM等集落，對臍血的造血重建能力有更為全面的反映，有助于臨床對臍血造血能力的評估。因此，相比H4534而言，GF-H4434是一種更適合臍血干細(xì)胞培養(yǎng)的體系。

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