謝水波 ，張亞萍，劉金香，劉迎九，李仕友，王勁松，劉海燕

(1.南華大學(xué) 城市建設(shè)學(xué)院，衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，衡陽(yáng) 421001)

我國(guó)鈾礦冶普遍采用溶浸采礦工藝，產(chǎn)生了大量的尾礦砂和尾礦水。鈾礦冶廢水中常存在大量的235U、238Pu等放射性核素，Cr、Mn、Fe以及取代苯、氯化烴類天然有機(jī)物等[1-3]，同時(shí)存在大量細(xì)菌等微生物。環(huán)境中的鈾以難溶性的U(Ⅳ)和水溶性的U(Ⅵ)為主，U(Ⅵ)多以鈾酰離子(UO22+)的形式在環(huán)境中遷移。在尾礦庫(kù)微環(huán)境中，殘余的 U(Ⅵ)、有機(jī)物、尾礦微生物等通過(guò)溶解、轉(zhuǎn)化水動(dòng)力作用等遷移，構(gòu)成持久性、潛在的放射性污染和重金屬毒害[4]。溶浸采礦理論的發(fā)展使鈾的化學(xué)釋放原理比較清晰，但微生物對(duì)鈾的直接或間接影響比較復(fù)雜，許多問(wèn)題尚不清楚。

在自然界中，腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens,S.putrefaciens)廣泛分布，常見(jiàn)于鈾尾礦地區(qū)有機(jī)質(zhì)含量豐富的沉積底泥環(huán)境與地下厭氧環(huán)境中。LOVLEY等[5]發(fā)現(xiàn)了微生物呼吸的新模式—腐殖質(zhì)呼吸，即呼吸鏈上的電子傳遞過(guò)程：在厭氧條件下，腐殖質(zhì)還原菌通過(guò)氧化電子供體，偶聯(lián)腐殖質(zhì)或腐殖質(zhì)模型物還原，從電子傳遞過(guò)程中貯存生命活動(dòng)需要的能量。在厭氧環(huán)境中，腐敗希瓦氏菌利用腐殖質(zhì)作為電子穿梭體，使可還原態(tài)物質(zhì)還原，如Fe(Ⅲ)[6-10]、Mn(Ⅳ)[9]、Cr(Ⅵ)[11]等重金屬、硝酸鹽[8]、有機(jī)污染物[8,10,12-15]等，且能促進(jìn)U(Ⅵ)的生物還原[11-12,16]。上述發(fā)現(xiàn)對(duì)進(jìn)一步研究鈾礦冶中微生物對(duì)鈾浸出的阻滯機(jī)理及含鈾廢水的生物處理具有重要意義?，F(xiàn)有報(bào)道中，關(guān)于腐敗希瓦氏菌降解偶氮類[10,14-16]有機(jī)物的較多，對(duì)其與U(Ⅵ)等放射性金屬的作用機(jī)理報(bào)道較少。

本文作者以腐敗希瓦氏菌為研究對(duì)象，探討重金屬及有毒有機(jī)物對(duì)其還原 U(VI)的影響，以及還原U(VI)的因素與機(jī)理，為揭示微生物對(duì)鈾浸出的阻滯機(jī)理及鈾礦冶廢水的生物處理提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

腐敗希瓦氏菌：購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC編號(hào)為22940。

培養(yǎng)基：NH4Cl 0.3 g/L，NaHCO32.5 g/L，MgSO40.025 g/L，MgCl2·6H2O 0.4 g/L，KH2PO4· 7H2O 0.02 g/L，酵母抽提物0.01 g/L(提供少量維生素和微量無(wú)機(jī)鹽)。

主要試劑：腐殖質(zhì)模式物蒽醌-2-磺酸鈉(Anthraquinone-2-sulfonate，AQS)，分析純，購(gòu)自 Sigma公司；U3O8(分析純)，標(biāo)準(zhǔn)鈾溶液采用 GBW04201方法配制；其他試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn))。

1.2 菌株的厭氧培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。在厭氧培養(yǎng)反應(yīng)器中，用丁基橡膠塞密封培養(yǎng)瓶口，高純氮?dú)夂投趸蓟旌蠚?V(N)2:V(CO)2=4:1)經(jīng)過(guò)裝有細(xì)菌過(guò)濾器的進(jìn)氣橡膠管充入到培養(yǎng)瓶中，此時(shí)出氣管打開，充氣時(shí)間≥15 min。充氣完畢后，用夾子封住所有橡膠管，使瓶口的剩余空間充滿混合氣體。水封，快速將其密封，于 30 ℃在生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每次取樣后，重新通氣，以確保厭氧環(huán)境。

圖1 厭氧培養(yǎng)裝置Fig.1 Anaerobic culture device

1.3 U()Ⅵ的測(cè)定

樣液預(yù)處理：用注射器從取樣管抽取適量體積菌體樣液，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，去除樣液中懸浮菌體。

U(Ⅵ)的測(cè)定：采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB6768-86分光光度法測(cè)定微量鈾。

1.4 腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ實(shí)驗(yàn)

向 500 mL錐形瓶中分別加入上述培養(yǎng)液 400 mL、5 mmol/L乙酸鈉和1 mmol/L AQS；用NaOH和HCI調(diào)節(jié)pH值，控制懸浮菌液OD600≈0.700 (約2.3 g/L，OD600指細(xì)菌懸浮液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值)，接種定量菌液到培養(yǎng)液中。

按1.2節(jié)操作后，定時(shí)取樣分析，測(cè)定培養(yǎng)液中剩余U(Ⅵ)濃度。

U(Ⅵ)初始濃度影響實(shí)驗(yàn)：U(Ⅵ)的初始濃度為10～80 mg/L，設(shè)有濃度梯度。

她望著火苗，氣得直跺腳，一邊打自己的耳光，一邊咒罵自己：“我真該死，我真該死哇，我為什么不清理灶門……”

菌體投加量影響實(shí)驗(yàn)：以懸浮菌液量表示，在0.50～10.0 mL的范圍內(nèi)，設(shè)置體積梯度。

AQS用量影響實(shí)驗(yàn)： AQS濃度為0～10 mmol/L，設(shè)置濃度梯度。

電子供體影響實(shí)驗(yàn)：以5 mmol/L的甲酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉為外加電子供體，以無(wú)外加電子供體作空白。

在單因素實(shí)驗(yàn)中，研究確定 pH值對(duì)腐敗希瓦氏菌腐殖質(zhì)還原 U(Ⅵ)的影響，結(jié)果表明，pH 值約為7.0時(shí)，U(Ⅵ)還原效率較高。因此，在本研究中，主要實(shí)驗(yàn)均在初始pH值約為7.0條件下完成。

1.5 有毒物質(zhì)對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

有毒有機(jī)物對(duì) U(Ⅵ)還原的影響：分別以 5 mmol/L甲苯、三氯乙酸和對(duì)硝基苯酚 3種有毒有機(jī)物作為電子供體，無(wú)外加電子供體作為空白，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

金屬離子對(duì) U(Ⅵ)還原的影響：分別加入一定濃度的Mn2+、Cr6+、Cu2+和Ca2+，以無(wú)外加金屬離子培養(yǎng)液作為對(duì)照，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

其他實(shí)驗(yàn)操作同1.2節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 U()Ⅵ初始濃度對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

目標(biāo)菌株對(duì)U(Ⅵ)耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)U(Ⅵ)的濃度為20 mg/L時(shí)，菌株的耐受性較好；當(dāng)濃度為50 mg/L時(shí)，其生長(zhǎng)受到較大抑制。當(dāng)U(Ⅵ)初始濃度為50 mg/L時(shí)，仍具有一定的還原效果，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中微量的H2PO4-與U(Ⅵ)結(jié)合，起緩沖作用，降低了 U(Ⅵ)對(duì)菌體的生物毒性。當(dāng) U(Ⅵ)初始濃度為10 mg/L時(shí)，24 h內(nèi)U(Ⅵ)的還原效率緩慢增加，推斷該過(guò)程是磷酸鈾酰分子緩慢被腐殖質(zhì)還原的過(guò)程。LING 和SZYMANOWSKT[17]報(bào)道，在培養(yǎng)液中加入一定量EDTA后，吸附在菌體表面的U(Ⅵ)濃度升高，促進(jìn)了U(Ⅵ)的還原。這也可以用來(lái)解釋微量H2PO4-對(duì)U(Ⅵ)還原的促進(jìn)作用。

當(dāng)U(Ⅵ)的初始濃度為30 mg/L時(shí)，在24 h內(nèi)，U(Ⅵ)的還原效率可達(dá)96%，具有較高的還原效率，以下實(shí)驗(yàn)均在此初始濃度條件下進(jìn)行。

圖2 U(Ⅵ)初始濃度對(duì)U(Ⅵ)還原的影響Fig.2 Effect of initial concentration of U(Ⅵ)on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

2.2 菌體投加量對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

圖3 菌體投加量對(duì)U(Ⅵ)的還原影響Fig.3 Effect of bacteria volume on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖3所示為菌體投加量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，在前10 h，U(Ⅵ)的還原效率隨菌體投加量的增加均顯著增大。當(dāng)菌體投加量為2 mL時(shí)，U(Ⅵ)的還原效率達(dá)到最高，超過(guò)閾值，U(Ⅵ)還原效率隨著菌體濃度的增加而略有降低。分 析認(rèn)為，在腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的過(guò)程中，需要一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、電子供體、AQS等，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境(配比)下，將出現(xiàn)較高還原效率。在最初階段中，隨著菌體量的增加，菌株間對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)作用增加，使得U(Ⅵ)的還原效率略有下降。24 h后，菌體投加量對(duì)U(Ⅵ)的還原效率的影響不大。

2.3 AQS用量對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

AQS對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如 4和5所示。結(jié)果表明，不同濃度的AQS對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響存在差異。

圖4 AQS濃度對(duì)U(Ⅵ)還原的影響Fig.4 Effect of AQS concentration on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖5 12 h時(shí)AQS濃度對(duì)U(Ⅵ)的還原效率的影響Fig.5 Effect of AQS concentration on reduction of U(Ⅵ)in 12 h by S.putrefaciens

當(dāng)AQS濃度在0～2 mmol/L范圍時(shí)，能顯著加速U(Ⅵ)的還原；當(dāng) AQS濃度為2 mmol/L時(shí)，在12 h內(nèi)，可將溶液中U(Ⅵ)濃度從30 mg/L降至1.91 mg/L，U(Ⅵ)還原效率達(dá)90%以上；當(dāng)其濃度高于2 mmol/L時(shí)，隨著AQS濃度的增加，U(Ⅵ)還原效率下降，AQS對(duì) U(Ⅵ)還原存在較強(qiáng)的抑制作用。這一結(jié)果表明，腐殖質(zhì)的確可作為氧化還原中間體穿梭于電子供體與U(Ⅵ)之間，促進(jìn)U(Ⅵ)的還原。但當(dāng)其濃度達(dá)到某一閾值時(shí)，它與U(Ⅵ)存在電子競(jìng)爭(zhēng)，使U(Ⅵ)還原效率反而下降。其原因在于其氧化還原電勢(shì)存在差異，細(xì)菌呼吸鏈的電子載體對(duì)AQS和U(Ⅵ)的親和力不同，使AQS濃度對(duì)U(Ⅵ)還原產(chǎn)生影響。

2.4 電子供體對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

外加電子供體對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響如圖6所示。由圖6可知，外加電子供體是影響腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的另一個(gè)重要因素。在12 h內(nèi)，加入甲酸鈉、乙酸鈉和乳酸鈉等外加電子供體的培養(yǎng)液，U(Ⅵ)的還原效率均在80%以上，與無(wú)外加電子供體的培養(yǎng)液相比，U(Ⅵ)的還原效率更高。外加電子供體不同，U(Ⅵ)的還原效率也略有差異。其原因如下：乳酸鈉、甲酸鈉和乙酸鈉的氧化還原電勢(shì)不同，如φΘ(乙酸鈉)= -120 mV，φΘ(甲酸鈉)=-430 mV[10]，甲酸鈉的失電子能力較乙酸鈉的更強(qiáng)，細(xì)菌對(duì)甲酸鈉的利用效率更高，因此，含甲酸鈉的培養(yǎng)液中 U(Ⅵ)的還原效率也更高。在無(wú)外加電子供體培養(yǎng)液中也觀測(cè)到一定的 U(Ⅵ)被還原，可能是溶液中存在的微量酵母菌膏充當(dāng)了電子供體。

圖6 電子供體對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響Fig.6 Effect of electron donors on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

3 環(huán)境有毒物質(zhì)對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響

3.1 有毒有機(jī)物對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，分別以甲苯、三氯乙酸和對(duì)硝基苯酚為電子供體，考察其對(duì)腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，3種物質(zhì)均可以作為電子供體支持 U(Ⅵ)的高效還原。在12 h內(nèi)，菌體利用甲苯、三氯乙酸和對(duì)硝基苯酚腐殖質(zhì)還原 U(Ⅵ)的效率分別達(dá)到 76.80%、94.89%和96.59%。與未加電子供體的培養(yǎng)液相比，顯著地促進(jìn)了U(Ⅵ)的還原。

圖7 有毒有機(jī)物對(duì)U(Ⅵ)還原的影響Fig.7 Effect of toxic organic compounds on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖8所示為有毒有機(jī)物作為電子供體促進(jìn) U(Ⅵ)還原的原理圖。腐敗希瓦氏菌通過(guò)酶促反應(yīng)氧化甲苯等有機(jī)物，AQS作為氧化還原中間體接受來(lái)自甲苯等提供的電子，其自身被還原，生成羥醌。還原態(tài)的AQS再將電子傳遞給U(Ⅵ)，完成還原過(guò)程。隨著AQS 氧化態(tài)與還原態(tài)形式的循環(huán)轉(zhuǎn)換，對(duì) U(Ⅵ)還原起明顯的促進(jìn)作用。同時(shí), 甲苯失去電子被氧化降解為CO2[10]。許志誠(chéng)等[15]在利用希瓦氏菌還原偶氮染料的實(shí)驗(yàn)中也有類似報(bào)道，推測(cè)存在更多有毒有機(jī)物質(zhì)可以作為電子供體支持腐敗希瓦氏菌腐殖質(zhì)還原U(Ⅵ)，但有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。這一工作對(duì)修復(fù)鈾尾礦庫(kù)區(qū)域的復(fù)合型污染具有一定的實(shí)用價(jià)值，對(duì)有毒有機(jī)物的降解具有重要的環(huán)境學(xué)意義。

圖8 有毒有機(jī)物作為電子供體促進(jìn)U(Ⅵ)還原的原理圖Fig.8 Mechanism of AQS mediated reduction of U(Ⅵ)with exogenous carbon as electron donors

3.2 金屬離子對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

考察 Cu2+、Ca2+、Cr6+和 Mn2+對(duì) U(Ⅵ)還原的影響，且研究菌株對(duì)各種離子的耐受性。結(jié)果表明，濃度為2.0 mmol/L的Cr6+、Cu2+和Mn2+均在菌株的耐受范圍內(nèi)。圖9～11所示為金屬離子作用下腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的結(jié)果。結(jié)果表明，在 4種金屬離子中，Ca2+和 Cu2+對(duì) U(Ⅵ)的還原影響顯著。與無(wú)外加金屬離子相比，60 h內(nèi)，2 mmol/L Ca2+使U(Ⅵ)的還原效率由97%降至42%。這可能是因?yàn)樵谒芤褐?，Ca2+與U(Ⅵ)生成鈣鈾碳酸鹽絡(luò)合物，使U(Ⅵ)的活性鍵被占用。鈣鈾碳酸鹽絡(luò)合物穩(wěn)定性較高，在 U(Ⅵ)接受電子時(shí)，U(Ⅵ)的活性鍵不易重新釋放，從而降低了U(Ⅵ)的氧化還原活性，影響了U(Ⅵ)的生物還原[17-18]。

圖9 重金屬離子對(duì)U(Ⅵ)還原的影響Fig.9 Effect of heavy metal ions on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖10 Cr6+濃度對(duì)U(Ⅵ)還原的影響Fig.10 Effect of Cr6+ concentration on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖11 Cu2+濃度對(duì)U(Ⅵ)還原的影響Fig.11 Effect of Cu2+ concentration on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

從圖9和10可以看出，Mn2+和Cr6+對(duì)腐殖質(zhì)還原U(Ⅵ)的影響較小。在60 h內(nèi)，與沒(méi)有外加重金屬離子的實(shí)驗(yàn)樣液對(duì)照，添加 1.0 mmol/L Cr6+、2.0 mmol/L Cr6+、2.0 mmol/L Mn2+于培養(yǎng)液中，U(Ⅵ)的還原效率分別降低了 1.85%、4.38%和 9.31%左右。VERRAMANI等[19]發(fā)現(xiàn) Mn2+對(duì)微生物還原 U(VI)的成礦作用和反應(yīng)生成的瀝青鈾礦結(jié)構(gòu)均有一定影響。本研究采用二苯碳酰二肼法測(cè)定了培養(yǎng)液中Cr6+的濃度，未觀察到Cr6+濃度的明顯變化。這是因?yàn)樵谥行原h(huán)境中，φΘ(Mn(Ⅱ)/Mn(s))=-1 029 mV、φΘ(Cr(Ⅵ)/Cr(Ⅲ))=-130 mV[11]，而φΘ(U(Ⅵ)/U(Ⅳ))= +273 mV，Cr(Ⅵ)和 Mn(Ⅱ)的得電子能力遠(yuǎn)弱于 U(Ⅵ)的得電子能力。因此，在電子傳遞過(guò)程中，Cr6+和Mn2+對(duì)U(Ⅵ)還原影響較小。GU和 CHEN[11]研究結(jié)果表明，在pH=3的酸性環(huán)境中，Cr6+被AQS化學(xué)還原；但在中性環(huán)境中，Cr6+生物還原作用不明顯，還原過(guò)程緩慢[20]，與本研究結(jié)果基本一致。當(dāng)環(huán)境變化時(shí)，Cr6+、Mn2+及 U(Ⅵ)的氧化還原電位也發(fā)生變化，可能會(huì)得到不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

當(dāng) Cu2+存在時(shí)，腐敗希瓦氏菌對(duì) U(Ⅵ)的還原結(jié)果如圖11所示。從圖11可以看出，Cu2+對(duì)U(Ⅵ)的還原具有強(qiáng)烈的抑制作用。當(dāng)Cu2+濃度為2 mmol/L時(shí)，在60 h內(nèi)，U(Ⅵ)的還原效率僅為12.7%。本課題組也研究了 Cu2+對(duì)硫酸鹽還原菌(SRB)還原 U(Ⅵ)的影響[18,21]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Cu2+與呼吸鏈?zhǔn)级嗣摎涿傅腇eS蛋白的活性中心相結(jié)合，破壞了蛋白的活性中心，從而使該蛋白質(zhì)失去氧化電子供體的能力，降低了U(Ⅵ)的生物還原效率[22]。本研究更進(jìn)一步證明了腐敗希瓦氏菌腐殖質(zhì)還原U(Ⅵ)的過(guò)程與電子傳遞鏈密切相關(guān)。

4 結(jié)論

1)在濃度為0～2 mmol/L范圍內(nèi)，AQS能顯著加速菌體對(duì)U(Ⅵ)的還原。當(dāng)AQS濃度為2 mmol/L 時(shí)，U(Ⅵ)的還原效率達(dá)到最大值，在12 h內(nèi)，U(Ⅵ)還原效率可達(dá)90%以上；當(dāng)AQS濃度高于2 mmol/L的濃度閾值時(shí)，隨著AQS濃度的增加，U(Ⅵ)的還原效率逐步降低。

2)在厭氧條件下，腐敗希瓦氏菌能利用多種有機(jī)酸鹽作為電子供體，以AQS作為電子穿梭載體，高效還原U(Ⅵ)。當(dāng)分別以5 mmol/L的甲酸鈉、乙酸鈉和乳酸鈉作為腐敗希瓦氏菌的外加電子供體時(shí), U(VI)的還原效率由高到低的順序?yàn)槿樗徕c、甲酸鈉、乙酸鈉。

3)甲苯、三氯乙酸和對(duì)硝基苯酚3種物質(zhì)均可以作為腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的電子供體，且具有較高U(Ⅵ)還原效率。腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的同時(shí)，可將甲苯、三氯乙酸和對(duì)硝基苯酚氧化降解。

4)環(huán)境有毒物質(zhì)對(duì)腐敗希瓦氏還原U(Ⅵ)的影響較大。Cr6+、Mn2+、Cu2+和Ca2+4種金屬離子對(duì)腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的影響存在較大差異。Cu2+和 Ca2+對(duì)腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)存在較強(qiáng)的抑制作用；Cr6+和 Mn2+對(duì)還原 U(Ⅵ)的影響相對(duì)較小。金屬離子對(duì)U(Ⅵ)還原的影響強(qiáng)弱與其離子濃度正相關(guān)。

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