應(yīng)用FIAstar5000和透析膜測(cè)定牛奶及乳制品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽

董瑋潔，許洪宇，辛躍珍

（完達(dá)山陽光乳業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱150078）

隨著乳品行業(yè)的迅速發(fā)展，乳品的質(zhì)量安全也越來越受重視。牛乳中的硝酸鹽和亞硝酸鹽（以下簡(jiǎn)稱兩鹽）的含量，也備受關(guān)注，而硝酸鹽含量的多少還受多種因素的影響，如：季節(jié)、天氣、菌落總數(shù)的多少、飼料等；而硝酸鹽在微生物等一定條件下作用，也會(huì)還原為亞硝酸鹽。亞硝酸鹽是一種致癌物質(zhì)，與人體血液作用，形成高鐵血紅蛋白，從而使血液失去攜氧功能，使人缺氧中毒，輕者頭昏、口唇，重者神志不清、抽搐、呼吸急促，搶救不及時(shí)可危及生命。不僅如此，亞硝酸鹽在人體內(nèi)達(dá)到一定劑量時(shí)是致癌、致畸、致突變的物質(zhì)，可嚴(yán)重危害人體健康。因此，兩鹽含量的檢測(cè)至關(guān)重要，而原奶數(shù)量的增多，國標(biāo)法檢測(cè)兩鹽，根據(jù)實(shí)際的檢驗(yàn)?zāi)芰?，只能進(jìn)行抽樣檢測(cè)，無法做到全部檢測(cè)，使得可能含有兩鹽的樣品漏檢，導(dǎo)致產(chǎn)品終端含有一定的亞硝酸鹽；用FIAstar5000和透析膜技術(shù)檢測(cè)兩鹽，檢測(cè)數(shù)量多，速度快，大型乳制品企業(yè)非常適用此法進(jìn)行檢測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FIAstar5000流動(dòng)注射分析儀（丹麥福斯公司）[1]；漩渦震蕩儀(PE-IKAMS3)；電熱鼓風(fēng)干燥箱；蒸餾水或去離子水，或者相當(dāng)于沒有硝酸根離子或亞硝酸根離子的水；磺胺，(4-氨基苯磺酰胺)；N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽；鹽酸，HCL，(ρ=1,19 g/ml)；亞硝酸鈉，NaNO2，在110℃～120℃干燥至恒重；硝酸鈉，NaNO3，在110℃～120℃干燥至恒重；氯化銨，NH4Cl，氨水；不起泡的實(shí)驗(yàn)室洗滌劑，例如：S470。

1.2 試劑的制備

緩沖溶液;用于萃取液，載液和試劑：在1000ml容量瓶中，用800ml水溶解26.6g 氯化銨(NH4Cl)，添加少量氨水(NH4OH)使得pH值達(dá)到8.5。稀釋至1000ml并混勻。

對(duì)氨基苯磺酰胺試劑：在500ml容量瓶中，用250ml蒸餾水溶解5g對(duì)氨基苯磺酰胺。添加25ml濃鹽酸，小心混合。用蒸餾水稀釋定容。

NED試劑：在500ml容量瓶中，用250ml蒸餾水溶解0.5g N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽(NED)，稀釋定容。此試劑應(yīng)每周重新配制，并保存在黑暗處。

硝酸鈉儲(chǔ)備溶液：在100ml容量瓶中，溶解137.1mg干燥后的NaNO3，稀釋定容成NaNO3濃度為1000mg/L，硝酸鈉定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋定容時(shí)使用緩沖溶液，定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)該每日新鮮配制，濃度為0；0.5；1；2；3；5(單位：μg/ml)。

亞硝酸鈉儲(chǔ)備溶液：在100ml容量瓶中，溶解150.0mg干燥后的NaNO2，稀釋定容成NaNO2濃度為1000mg/L。亞硝酸鈉過渡儲(chǔ)備液：在100ml容量瓶中，移取5.00ml亞硝酸鈉儲(chǔ)備液，用蒸餾水稀釋定容成NaNO2濃度為50 mg/L，亞硝酸鈉定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。用緩沖溶液稀釋定容，定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)該每日新鮮配制，濃度為0；0.025；0.050；0.100；0.200；0.400(單位：μg/ml)。

2 前處理方法

2.1 樣品的制備

使用一個(gè)合適的碾磨設(shè)備(4.8)將樣品碾碎。將碾碎的物質(zhì)迅速混合均勻，如果可能，再碾磨一次，然后混合均勻。每碾磨一個(gè)樣品之后將設(shè)備清理干凈。如果待測(cè)部分不能被碾磨，通過強(qiáng)力的攪拌和揉捏將其混合均勻。碾磨之后馬上將樣品轉(zhuǎn)入帶密封蓋的樣品容器待測(cè)。更好的方法是沒有任何耽擱，如果不可避免，做好各種防范措施來確保待測(cè)樣品保存完好。不要再對(duì)碾磨后出現(xiàn)霉變或開始變質(zhì)的奶酪樣品進(jìn)行分析了。液態(tài)奶制品，在50ml離心管中加入5g待測(cè)樣品，稱量準(zhǔn)至0.5mg。將萃取緩沖溶液(試劑3.10)預(yù)先加熱到50℃～55℃，取24ml加入到包含測(cè)試樣品的離心管。在均質(zhì)器中攪拌3分鐘，被測(cè)部分充分分散。在離心機(jī)中處理待測(cè)試液5分鐘(1500g)。將分離后的離心管置于冰水混合物中冷卻15分鐘。用移液管將離心管中脂肪層下面的脫脂溶液吸出用于流動(dòng)注射測(cè)定。

2.2 樣品測(cè)定步驟

1. 打開FIAstar分析儀主機(jī)及5027采樣器電源(如果采用取樣器)。

2. 確認(rèn)安裝的測(cè)試盒及使用的檢測(cè)器濾光片是否正確。

3. 開啟蠕動(dòng)泵，將各管路接蒸餾水，檢查流路連接是否正常。

4. 打開計(jì)算機(jī)，啟動(dòng)分析軟件，調(diào)入方法。

5. 使用SOFIA軟件中的Inspect/Read baseline菜單觀察水的基線讀數(shù)，SD(M-R)＜0.1 mAU。

6. 泵入試劑，確認(rèn)測(cè)試盒指示的位置是NO2分析。

7. 當(dāng)系統(tǒng)充滿液體，將測(cè)試盒指示的位置轉(zhuǎn)到NO2+NO3分析。

8. 繼續(xù)泵入試劑直到旁路泵管中的空氣全部被排凈。

圖1 典型亞硝酸鹽校正圖譜

圖2 典型硝酸鹽校正圖譜

9. 將泵停止工作，取下旁路泵管，并安裝上鎘柱。

10. 啟動(dòng)泵，讓試劑流動(dòng)直到穩(wěn)定。

11. 使用SOFIA軟件中的Inspect/Read baseline菜單觀察試劑的基線讀數(shù)，SD(M-R)＜0.2 mAU。

12. 將樣品放到進(jìn)樣器中，并在SoFIA軟件中創(chuàng)建一個(gè)樣品表。

13. 將定標(biāo)樣品放到進(jìn)樣器中。

14. 將定標(biāo)系溶液置于進(jìn)樣器，取一標(biāo)準(zhǔn)樣品注射幾次，檢查流路是否平衡并檢查系統(tǒng)是否工作正常。通常不同的注射其差別不應(yīng)超過mAU或ppm讀數(shù)的2%。

15. 同時(shí)檢查鎘柱的還原效率。16. 制作定標(biāo)/檢查定標(biāo)。

17. 啟動(dòng)樣品表，開始檢測(cè)。

2.3 檢出限

實(shí)驗(yàn)檢出范圍：硝酸鹽：浸提液中0.5-5mg/l NO3-,相當(dāng)于原奶中10-100mg/kg NO3-；

亞硝酸鹽：浸提液中0.025-0.4mg/l NO2-,相當(dāng)于原奶中0.5-8mg/kg NO2-，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2 =0.9999。

最低檢出限以三倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差[2]除以工作曲線的斜率求得硝酸鹽檢出限為0.552μg/mL；亞硝酸鹽檢出限為0.0885μg/mL。

2.4 回收率試驗(yàn)

取一組已經(jīng)測(cè)定含量的樣品，每個(gè)各三份，第一份加入標(biāo)準(zhǔn)液后使它的濃度與樣品含量基本相同，第二份加入標(biāo)準(zhǔn)液加入后使總濃度接近線性范圍上限，第三份加入標(biāo)準(zhǔn)液后使它的濃度接近（或略大于）檢測(cè)下限，然后測(cè)定算出回收率。

本方法硝酸鹽的低濃度回收率為106%，高濃度的回收率為97.8%，與樣品相當(dāng)濃度的回收率為99.8%；亞硝酸鹽的低濃度回收率為100%，高濃度的回收率為99.0%，與樣品相當(dāng)濃度的回收率為97.0%.均符合試驗(yàn)要求。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

在樣品開始分析前，儀器需要預(yù)熱15分鐘。以下的常規(guī)操作過程將自動(dòng)允許一個(gè)合適的預(yù)熱時(shí)間。在啟動(dòng)分析之前，系統(tǒng)需要通過泵入試劑10分鐘來平衡。避免在分析或校準(zhǔn)期間停泵，因?yàn)檫@將破壞流路平衡。如果必須停泵，再次啟動(dòng)泵后，讓系統(tǒng)平衡幾分鐘。為了彌補(bǔ)運(yùn)行多個(gè)樣品時(shí)出現(xiàn)的漂移，建議每30分鐘進(jìn)行自動(dòng)再校準(zhǔn)。整個(gè)分析時(shí)間包括吸入、反應(yīng)、檢測(cè)和清洗，一個(gè)樣品大概50~70秒。從檢測(cè)器獲得的信號(hào)進(jìn)入SoFIA的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。通過已知濃度的樣品校準(zhǔn)曲線，儀器可以計(jì)算出樣品的濃度。

用此方法檢測(cè)兩鹽，檢測(cè)流程簡(jiǎn)單、速度快、檢測(cè)數(shù)量多、準(zhǔn)確度高、批量檢測(cè)更節(jié)省成本。乳制品企業(yè)用此法，可更好的判斷分析從原料奶到產(chǎn)成品的質(zhì)量，將不合格隱患及早發(fā)現(xiàn)，以杜絕兩鹽超標(biāo)的產(chǎn)品流通。

[1]陳培榕 李景虹 鄧勃 . 現(xiàn)代儀器分析實(shí)驗(yàn)與技術(shù)：清華大學(xué)出版社

[2]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.33-2011食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測(cè)定，第三法。