林毅剛， 夏 鋼

（華東師范大學(xué) 腦功能基因組學(xué)教育部重點實驗室、上海市腦功能基因組學(xué)重點實驗室，上海 200062）

α-N-乙酰半乳糖胺酶的表達及活性檢測

林毅剛， 夏 鋼

（華東師范大學(xué) 腦功能基因組學(xué)教育部重點實驗室、上海市腦功能基因組學(xué)重點實驗室，上海 200062）

為了建立新型α-N-乙酰半乳糖胺酶的篩選、檢測方法，實驗中提取腦膜金黃桿菌的基因組DNA，以此為模板PCR擴增出α-N-乙酰半乳糖胺酶（A4）.將A4克隆至pET-24a載體，轉(zhuǎn)化Bl21表達菌株進行蛋白表達.使用親和層析方法純化His-A4酶，選擇顯色底物驗證酶活性.同時，改進了傳統(tǒng)的ELISA方法，直接將紅細胞膜包被于ELISA檢測平板中，以紅細胞膜表面抗原作為直接底物，用ELISA方法檢測酶活性.此研究建立了新型ELISA實驗方法，以此方法驗證了A4酶的活性，證明了此酶能夠有效降低紅細胞表面抗原抗體反應(yīng)，且具有濃度和時間依賴性.

α-N-乙酰半乳糖胺酶； 重組蛋白； 蛋白純化； ELISA方法

ELISA method

0 引 言

1900年Landsteiner發(fā)表論文［1］，闡述了人類紅細胞表面ABO血型抗原并根據(jù)紅細胞表面抗原的差異，將人血劃分為A、B、AB和O4種血型.1980年 Watkins等3位科學(xué)家分別闡述了紅細胞表面ABO抗原的碳水化合物結(jié)構(gòu)［2］.暴露于紅細胞表面的寡糖鏈上糖基的種類和順序決定了紅細胞表面的抗原.紅細胞先在表面合成抗原H，若將乙酰半乳糖胺基連接在抗原H肽鏈中的半乳糖上，這就形成了抗原A，相應(yīng)的紅細胞稱為A型紅細胞；同理，若半乳糖被連接至同樣位置，成為抗原B，這樣就形成了B型紅細胞；若紅細胞的表面既有抗原A又有抗原B，則形成AB型紅細胞.

在輸血治療中，由于紅細胞表面抗原與血清中抗體的存在，因此如果接收到相同血型血液的輸血，不會發(fā)生意外.但如果錯誤輸血，抗原抗體發(fā)生凝集，可造成紅細胞裂解，產(chǎn)生急性血管內(nèi)溶血性輸血反應(yīng)，從而可能致人死亡［3］.而O型紅血液中紅細胞不含A、B抗原，所以可以安全地輸給A、B、AB與O型的受血者，因此O型血往往被稱為“通用血”（universal red blood cells，RBCs）［4］.通用型血可以極大減少因ABO血型不合所致輸血反應(yīng)，明顯提高輸血安全性，因此將其它血型轉(zhuǎn)換成O型通用血具有重要意義.

使用酶切方法將紅細胞表面最外端的糖苷切除，從而消除抗原抗體反應(yīng)是一種常用的制備通用紅細胞的方法.研究證明［5］α-半乳糖苷酶作用于兩個半乳糖之間的糖苷鍵，將B抗原最外端的半乳糖切除；α-N-乙酰半乳糖胺酶則作用于半乳糖和N-乙酰半乳糖胺之間的糖苷鍵，將A抗原最外端的N-乙酰半乳糖胺切除.這兩種酶可以分別作為B→O和A→O血型轉(zhuǎn)變的工具酶.

Goldstein等人在1982年最早提出酶解法制備通用型RBC［6］，并從咖啡豆克隆了α-半乳糖苷酶基因，在臨床二期檢驗成功，實現(xiàn)B→O血型改造［7］.相比之下，A→O血型改造進展緩慢，Goldstein認為原因是［8］自然界的α-N-乙酰半乳糖胺酶的數(shù)量比α-半乳糖胺酶少.

目前，科學(xué)家已從植物、海洋生物和動物臟器中發(fā)現(xiàn)了可以用以切除紅細胞表面抗原最外端糖苷的多種糖苷酶，它們的酶切效率、作用溫度和作用pH各不相同.Liu［4］等人在最近的研究中，報導(dǎo)了他們從2 500多種細菌與真菌中篩選出一種糖苷酶，具有α-N-乙酰半乳糖胺酶的活性，可以比較高效地切除A型紅細胞表面的N-乙酰半乳糖胺.此酶反應(yīng)條件溫和，活性是已報道的α-N-乙酰半乳糖胺酶中最好的.在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中基因登錄號為AM039444［4］（為方便表示，此基因在本文內(nèi)代稱為A4）.經(jīng)過晶體結(jié)構(gòu)的測定，此酶的空間結(jié)構(gòu)已非常清楚，因此選取此酶用于實驗.此基因全長為1 335 bp，編碼的蛋白分子量約為50.5 kD，試驗酶解A型表面抗原.

本文從細菌基因組DNA中PCR擴增出目的基因，在表達菌株中誘導(dǎo)蛋白表達，用ELISA方法檢測，α-N-乙酰半乳糖胺酶確實可以除去A型紅細胞表面最外側(cè)的糖苷，為進一步大量制備α-N-乙酰半乳糖胺酶用于制備通用型血奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

克隆載體pET24a購自美國Novagen公司，大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21（DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司.

A4基因所在的細菌名為Chryseobacterium meningosepticum，ATCC登錄號為33958，購自美國ATCC菌株庫.

1.1.2 主要試劑

HindIII與SacI購自美國NEB公司，Taq酶、dNTP、DL2000 Marker和1 kbp Marker等常用試劑購于Takara大連有限公司.其它所有用到的化學(xué)試劑均為市售分析純.對硝基苯酚-N-乙酰-α-半乳糖胺（PNP-A）購自美國Sigma公司.抗A血型定型試劑購自上海血液所.二抗羊抗鼠與TMB顯色液，5×SDS蛋白上樣緩沖液和BCA試劑購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，蛋白Marker PageRuler Prestained Protein Ladder購自美國Fermentas公司.鎳柱（Ni2＋agarose）購自美國Bio-Rad公司.質(zhì)粒小提試劑盒，膠回收試劑盒，PCR回收試劑盒均購自上海捷瑞生物有限公司.PCR引物由Invitrogen上海分公司合成.

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR擴增序列與原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI報道的序列編號AM039444（A4），設(shè)計引物擴增序列，具體序列為

PCR程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 min，72℃延伸1 min30 s，36個循環(huán)，最后72℃延伸10 min.

DNA回收試劑盒回收A4基因片段與克隆載體pET24a，均經(jīng)過SacI和HindIII雙酶切，將目的片段與載體片段用DNA回收試劑盒回收，將目的片段與載體連接，構(gòu)建成質(zhì)粒pET24a-A4，構(gòu)建的pET24a-A4用SacI與HindIII雙酶切鑒定，并經(jīng)過測序驗證序列的正確性.

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)

將正確的重組質(zhì)粒pET24a-A4，轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后，挑取單克隆到5 mL含50μg／mL卡那霉素（Kana）的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜搖菌.次日以1∶100接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（50μg／mL Kana），于37℃搖床振蕩培養(yǎng)，至吸光度（OD 值）達0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol／L.20℃下進行誘導(dǎo)表達，4 h后取1 mL培養(yǎng)物于8 000 r／min下離心5 min，菌液重懸于PBS緩沖液中，用超聲破碎儀以20 kHz的頻率超聲破碎菌液，12 000 r／min離心5 min，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸5 min，收集含重組表達的蛋白備用.取10μL上述處理好的重組蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離鑒定，考馬斯亮藍染色.

1.2.3 重組蛋白的純化

挑取單克隆到20 mL含50μg／mL Kana的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng).次日以1∶100接種于1 L LB液體培養(yǎng)基中（50μg／mL Kana），過夜誘導(dǎo)表達蛋白（具體步驟同重組蛋白的誘導(dǎo)）.8 000 r／min離心5 min，收集全部菌液，PBS漂洗兩遍后，加入30 mL PBS超聲破碎細菌，12 000 r／min 4℃離心20 min，取上清，參照Bio-Rad實驗操作手冊，上清與Ni＋親和層析柱結(jié)合，用全自動快速蛋白液相層析系統(tǒng)儀器純化蛋白.

具體步驟 5 mmol／L咪唑緩沖液10 mL平衡整個系統(tǒng)（1 mL體積鎳柱）；上樣30 mL上清溶液；10 mmol／L咪唑緩沖液10 mL洗去非特異結(jié)合蛋白；咪唑緩沖液濃度逐步提高，從10 mmol／L至250 mmol／L洗脫目的蛋白；最后用1 mol／L咪唑緩沖液10 mL洗脫全部蛋白.收集所有流出液以備SDS-PAGE檢測.

1.2.4 酶活性測定

α-N-乙酰半乳糖胺酶對底物對硝基苯酚-N-乙酰-α-半乳糖胺（PNP-A）有專一性，能夠特異性酶解該底物，水解后的顯色基團對硝基苯酚將顯出黃顏色，通過此方法證實酶有活性.以顯色反應(yīng)的進行程度作為酶活性的判斷標志.在酶反應(yīng)過程中通過連續(xù)觀測吸收值ΔOD400／t，對酶解效率進行測定，計算其Kcatobserve，以評價酶活性.

測定PNP標準曲線 標準曲線橫坐標為PNP-A的濃度（μmol／L），縱坐標為OD值，通過此曲線，可從OD值的讀數(shù)計算出酶作用于底物后反應(yīng)生成的產(chǎn)物濃度.

取200μL A4酶溶液（200μmol／L，酶濃度過量），加入等體積PNP-A溶液，使底物終濃度分別為2.5、5、10和20μmol／L.充分反應(yīng)后，讀取在400 nm的光吸收值.根據(jù)數(shù)值，以濃度對OD值作圖，得到PNP-A標準曲線，以計算對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)（ε）（濃度為1 mol／L時的吸光系數(shù)）.

Kcatobserve測定 200μL0.2μmol／L的A4酶溶液，加入PNP-A，終濃度為50μmol／L，立即開始毎10 s讀取一次OD400，得到產(chǎn)物生成曲線，計算反應(yīng)初期線性階段的斜率K（OD／t），按照如下公式計算Kcatobserve＝K×ε／（A4酶摩爾濃度）.

1.2.5 ELISA鑒定

取5 mL A型紅細胞，用75 mmol／L的氯化鉀低滲液溶脹處理，3次低滲溶液洗滌離心，再經(jīng)3次生理鹽水洗滌離心后，得到較純凈的細胞膜懸濁液.將破碎的紅細胞膜懸濁液用PBS稀釋至相當(dāng)于107個紅細胞／mL，加入96孔ELISA酶標板100μL／孔，室溫包被2 h，用PBS洗板5次；加入用PBS稀釋的1%BSA100μL／孔，室溫封閉1 h，PBS洗板5次；加入100μL純化的A4酶，毎孔100μL，終濃度分別為3.3、10、33和100μg／mL，37℃放置過夜，PBS洗板5次；將1%BSA稀釋10倍的抗A血型定型試劑加入酶標板，37℃孵育1 h，PBS洗板5次；二抗羊抗鼠IgG用1%BSA稀釋3 000倍加入酶標板，37℃孵育1 h，PBS洗板5次；充分清洗二抗殘余，毎孔加入TMB顯色液50μL／孔，室溫避光孵育5 min；毎孔加入2 mol／L H2SO4，50μL／孔，終止顯色反應(yīng)；讀取450 nm的光吸收值.

2 結(jié) 果

2.1 pET24a-A4重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以細菌基因組DNA為模板，利用A4基因上游引物A4-F和下游引物A4-R進行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，在1 000 bp上方可見約1 350 bp的擴增產(chǎn)物（見圖1a）；擴增的基因片段經(jīng)測序鑒定后，閱讀框完整，與報道的A4基因一致，說明擴增出A4基因.將構(gòu)建了的重組質(zhì)粒pET24a-A4，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后，挑取單克隆提質(zhì)粒后，經(jīng)SacI和HindIII雙酶切驗證，在瓊脂糖凝膠電泳圖中可見一條約1 350 bp的目的基因條帶與一條約5 000 bp的載體條帶（見圖1b），與預(yù)期一致，經(jīng)測序后證明A4基因插入在SacI和HindIII兩個酶切位點之間，pET24a-A4重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖1 pET24a-A4重組質(zhì)粒的構(gòu)建（單位：bp）Fig.1 Construction of pET24a-A4 plasmid（Unit：bp）

2.2 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達

將質(zhì)粒pET24a-A4轉(zhuǎn)入表達菌株BL21（DE3）進行誘導(dǎo)表達，表達后的菌體進行超聲破碎，離心后分別收集上清與沉淀，10%的SDS-PAGE電泳分析，經(jīng)考馬斯亮藍染色及脫色后，與未誘導(dǎo)的pET24a-A4相比，在55 kD的下方處可見一條明顯的增粗的新生蛋白條帶（見圖2），與預(yù)期分子量52 kD相符.目的蛋白主要存在于上清中，部分在沉淀中.

圖2 A4蛋白誘導(dǎo)表達（單位：kD）Fig.2 Expression of His-A4（Unit：kD）

2.3 A4蛋白的純化分析

pET24a-A4質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后，目的蛋白與帶His-tag標簽可形成融合蛋白，His-tag可與鎳柱結(jié)合，通過親和層析方法純化蛋白.對成功誘導(dǎo)的菌株進行大量培養(yǎng)誘導(dǎo)后，將菌體超聲破碎后，蛋白溶于上清PBS中，取上清過鎳柱純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離與考馬斯亮藍染色分析.純化后的A4蛋白為單一的蛋白條帶（見圖3），雜帶較少，且與誘導(dǎo)表達的蛋白大小一致，說明純化效果很好.經(jīng)BCA方法測定，蛋白濃度為4.2 mg／mL.

圖3 A4蛋白純化（單位：kD）Fig.3 Purification of His-A4 protein（Unit：kD）

2.4 重組蛋白對底物PNP-A的活性測定

將純化后的蛋白樣品進行活性檢測.實驗中，為了測定PNP-A濃度與對應(yīng)OD400值的關(guān)系，先用40μmol／L的初始濃度，按2倍做倍比稀釋，做20、10、5和2.5μmol／L4個濃度梯度，繪制PNP-A的標準曲線.

被檢His-A4蛋白濃度稀釋至0.2μmol／L進行測定（見圖4），測得10 s的反應(yīng)速率為酶反應(yīng)的初速度，即Δt為10 s，斜率為0.005ΔOD／t，根據(jù)PNP標準曲線可計算出產(chǎn)物生成速率為0.242 1μmol·L－1·s－1，計算酶動力得Kcatobserve＝Δ［PNP－A］／（Δt×A4酶摩爾濃度）＝1.159 s－1.

2.5 ELISA方法檢測用酶處理過的紅細胞與抗A定型試劑反應(yīng)

紅細胞破碎后離心得到的紅細胞膜，預(yù)先包埋在酶標板底部，摸索建立新穎的ELISA方法對純化過后的酶進行活性檢測，用酶處理A型血液的紅細胞，α-N-乙酰半乳糖胺酶能酶解A型紅細胞表面的抗原.實驗證明，當(dāng)A型紅細胞膜沒有用酶處理時，與抗A定型試劑反應(yīng)效果較強，OD值較高，而酶解過后A型細胞表面抗原就會減少，與抗A定型試劑反應(yīng)就會變?nèi)?不同酶濃度對紅細胞的影響不同，隨著酶濃度的增高3.3、10、33和100μg／mL，OD450值就越低（見圖5），說明酶能切除細胞表面的抗原，抗原抗體反應(yīng)降低.同樣隨著酶作用的時間延長，抗原抗體反應(yīng)就越弱（見圖6），說明酶確實能夠切除A型紅細胞最外的糖苷，與抗A定型試劑反應(yīng)降低.

圖4 酶反應(yīng)的初速度計算Fig.4 Calculation of the initial velocity of enzyme reaction

圖5 不同酶濃度下的ELISA檢測效果Fig.5 Detection effects of ELISA at different concentrations of enzyme

圖6 不同時間下的ELISA檢測效果Fig.6 Detection effects of ELISA at different times of enzyme

3 討 論

血液短缺是世界性難題，各國科學(xué)家都在努力攻克.如果能將其它血型的血液轉(zhuǎn)換為O型血，并且輸血安全有效，那么這通用型血液具有巨大的經(jīng)濟與臨床價值［9，10］，同時對鐮刀貧血癥、地中海貧血癥和白血病等需要反復(fù)輸血以維持生命的病人使用通用型血，也是理想的輸血治療方案［6，11，12］.

本實驗克隆了以往報道的活性最好的α-N-乙酰半乳糖胺酶基因，并在細菌中進行過表達所編碼的蛋白，在IPTG終濃度為1 mmol／L，37℃過夜誘導(dǎo)的條件下，SDS-PAGE分析后得到52 kD的蛋白，絕大部分蛋白形成包涵體在沉淀中.因此重新優(yōu)化了誘導(dǎo)條件，在IPTG終濃度為0.4 mmol／L，低溫20℃過夜誘導(dǎo)的條件下，經(jīng)SDS-PAGE分析后，可知重組A4酶經(jīng)低溫誘導(dǎo)可表達，產(chǎn)生活性蛋白，易于純化，為大規(guī)模純化提供實驗依據(jù).

為了證明α-N-乙酰半乳糖胺酶可消除A型紅細胞表面的抗原，本文改進了傳統(tǒng)的ELISA方法，直接將紅細胞膜包被于ELISA檢測平板中，以紅細胞膜表面抗原作為直接底物，用ELISA方法對改造過后的A型紅細胞進行抗體凝集檢測.本實驗中建立的新型ELISA方法驗證了A4酶的活性，證明了此酶能夠有效降低紅細胞表面抗原抗體反應(yīng)，且具有濃度和時間依賴性.此優(yōu)化的ELISA方法的另一個優(yōu)點在于更加接近實際情況，酶直接作用于紅細胞膜，不但可以檢測酶活性，更可以體外模擬A型血轉(zhuǎn)化為O型血，為以后相關(guān)檢測提供了檢測方法.

我國科學(xué)家已經(jīng)使用α-半乳糖苷酶實現(xiàn)B型血向O型血的轉(zhuǎn)化［13］，但是A型血的轉(zhuǎn)化仍然不順利，主要難題是酶活性較低.目前科研人員在自然界中繼續(xù)尋找α-N-乙酰半乳糖胺酶，期望得到活性更高的酶.另一方面，針對已經(jīng)報道的酶，運用基因重組等分子生物學(xué)手段過量表達蛋白的工作也在積極進行.但是現(xiàn)有的α-N-乙酰半乳糖胺酶催化效率仍然比較低，無法用于實際生產(chǎn).由此可見，利用糖苷酶酶解紅細胞表面抗原上的糖分子，從而得到通用紅細胞是一項具有巨大潛力的技術(shù)方案，前人已經(jīng)在這方面做出了不懈的努力，但是至今人們沒有得到理想的工具酶.本實驗室構(gòu)建的A4基因，已成功改變了A型紅細胞表面抗原的結(jié)構(gòu)，下一步擬進行通過體外進化技術(shù)——DNA改組（DNA shuffling）［14］，提高酶活性.期望得到活性高的酶，為大規(guī)模血型轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ).

［1］ LANDSTEINER K.Agglutination phenomena of normal human blood［J］.Wiener Klinische Wochenschrift，2001，113（20-21）：768-769.

［2］ WATKINS W M.Biochemistry and genetics of the ABO，Lewis，and P blood group systems［J］.Advances in Human Genetics，1980（10）：1-136，379-385.

［3］ 章?lián)P培，季守平，楊軍.血型轉(zhuǎn)變［J］.中國實驗血液學(xué)雜志，1998，6（2）：91-97.

［4］ LIU Q P，SULZENBACHER G，YUAN H，et al.Bacterial glycosidases for the production of universal red blood cells［J］.Nature Biotechnology，2007，25（4）：454-464.

［5］ BAEHR R V.Biotechnology of blood［J］.Biotechnology，1991，19：1-463.

［6］ GOLDSTEIN J，SIVIGLIA G，HURST R，et al.Group B erythrocytes enzymatically converted to group O survive normally in A，B，and O individuals［J］.Science，1982，215（4529）：168-170.

［7］ KRUSKALL M S，AUBUCHON J P，ANTHONY K Y，et al.Transfusion to blood group A and O patients of group B RBCs that have been enzymatically converted to group O［J］.Transfusion，2000，40（11）：1290-1298.

［8］ ZHU A，GOLDSTEIN J.Cloning and functional expression of a cDNA encoding coffee bean alpha-galactosidase［J］.Gene，1994，140（2）：227-231.

［9］ OLSSON M L，CLAUSEN H.Modifying the red cell surface：towards an ABO-universal blood supply［J］.British Journal of Haematology，2008，140（1）：3-12.

［10］ DANIELS G，WITHERS S G.Towards universal red blood cells［J］.Nature Biotechnology，2007，25（4）：427-428.

［11］ LENNY L L，GOLDSTEIN J.The production of group O cells［J］.Biotechnology，1991，19：75-100.

［12］ LAVECCHIO J A，DUNNE A D，EDGE A S.Enzymatic removal of alpha-galactosyl epitopes from porcine endothelial cells diminishes the cytotoxic effect of natural antibodies［J］.Transplantation，1995，60（8）：841-847.

［13］ 楊軍，宮鋒，季守平.B→O血型轉(zhuǎn)變工具酶α-半乳糖苷酶cDNA克隆及表達［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2000，16（4）：438-442.

［14］ STEMMER W P.Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling［J］.Nature，1994，370（6488）：389-391.

Overexpression and characterization of a bacterial α-N-acetylgalactosaminidase

LIN Yi-gang， XIA Gang

（Key Laboratory of Brain Functional Genomics，Ministry of Education，Shanghai Key Laboratory of Brain Functional Genomics，East China Normal University，Shanghai 200062，China）

The coding sequence of alpha-N-acetylgalactosaminidase（A4）was amplified from genomic DNA of Chryseobacterium meningosepticumand subcloned into pET24a，which was then transformed into BL21（DE3）for overexpression of His-A4.The overexpressed His-A4 enzyme was purified by using affinity chromatography and its activity was comparable to that previously reported by using a conventional method with an artificial substrate.To better measure the activity ofα-N-acetylgalactosaminidase in real application，we established a novel method in which we directly used the surface antigen of red blood cell as substrate and applied ELISA to the detection of un-cleaved antigen.The activity of His-A4 was evaluated in the new ELISA method and was demonstrated to be able to decrease the blood cell surface antigen-antibody reaction in concentration-and time-dependent manner.

α-N-acetylgalactosaminidase； recombination protein； protein purification；

Q55

A

10.3969／j.issn.1000-5641.2012.04.009

1000-5641（2012）04-0067-08

2011-05

教育部重點項目（V200704）

林毅剛，男，碩士研究生.

夏鋼，男，研究員.E-mail：gxia＠brain.ecnu.edu.cn.