潘慧娟，尹洪萍，陳功星

（杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心，浙江杭州 310036）

制片式細胞培養(yǎng)板的制作及其實用性研究

潘慧娟，尹洪萍，陳功星

（杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心，浙江杭州 310036）

為了研發(fā)一種集成細胞培養(yǎng)和制片功能的生物技術(shù)產(chǎn)品，通過在24孔細胞培養(yǎng)板上進行設(shè)計制作，再進行SW480細胞培養(yǎng)，最后經(jīng)瑞氏－吉姆薩染色分析，結(jié)果表明，該技術(shù)產(chǎn)品能夠把細胞培養(yǎng)與細胞制片完美的結(jié)合起來，具有一定的創(chuàng)新和實用價值.

細胞培養(yǎng)；制片；創(chuàng)新；實用

細胞培養(yǎng)研究的發(fā)展，很大程度上是建立在新方法、新發(fā)明的基礎(chǔ)之上.細胞培養(yǎng)研究中的任何技術(shù)上的進步，都能極大地促進細胞研究工作的開展.細胞制片是細胞培養(yǎng)研究中一個重要的技術(shù)內(nèi)容，它是細胞形態(tài)分析以及免疫組織化學(xué)技術(shù)中一個必不可少的操作過程，即把細胞附著于透明的支撐物上.現(xiàn)有商品化的內(nèi)置玻璃片無菌培養(yǎng)皿用于培養(yǎng)細胞制片，取得了一定程度的成果，被廣大生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、教學(xué)人員認同.作者曾對該產(chǎn)品在細胞培養(yǎng)制片方面做了一定的改善［1］，但還存在一些不足，尚有一定的發(fā)展空間.作者在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用了更加安全、實用的方法，研制出了集細胞培養(yǎng)和制片功能于一體的制片式細胞培養(yǎng)板（該產(chǎn)品已獲專利，專利號：201020257177.7），并對其實用性進行了研究.

1 材料與方法

1.1 材料

小牛血清、RMPI－1640和24孔細胞培養(yǎng)板均購于GIBCO公司.篆刻刀、三角板、圓規(guī)、鉛筆均購于杭州文教用品店.配制瑞氏染色液（瑞氏染料1g＋甲醇600mL）、（pH 6.4～6.8）磷酸鹽緩沖液PBS（1000 mL中含磷酸二氫鉀0.3g＋磷酸氫二鈉0.2g）、姬姆薩染色液（姬姆薩燃料1g＋甘油66mL＋甲醇66 mL）.

1.2 方法

1.2.1 制片式細胞培養(yǎng)板的制作

取廢棄的24孔培養(yǎng)板，圓規(guī)、三角板測量孔內(nèi)徑（R），根據(jù)公式計算不同等邊多邊形的每條邊長度（L）：L＝R＊con［（180°（－360°（/n）/2］（n為多邊形的邊數(shù)），計算多邊形的邊長，再取無菌同樣的24孔細胞培養(yǎng)板，去除無菌包裝，保持封蓋狀態(tài).用三角板和鉛筆在孔底背面按照邊長（L）繪出相應(yīng)的多變形，然后用篆刻刀雕刻，形成溝槽，以便于方便取出每個孔底板.并在每個孔底板背面的一側(cè)用篆刻刀寫出標記.

1.2.2 細胞制片

經(jīng)制備過的制片式細胞培養(yǎng)板，紫外光下照射0.5h，然后按照細胞培養(yǎng)操作，取人大腸癌細胞SW480，1×106接種于細胞培養(yǎng)板孔中，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清（經(jīng)56℃水浴30min滅活）的RMPI－1640培養(yǎng)液中（含100U/mL的青、鏈霉素），在37℃、5%CO2濃度及飽和濕度條件下進行培養(yǎng).24h后，取出培養(yǎng)板盡量棄去培養(yǎng)液，1200rpm離心5min后，立即用吸管吸棄24孔板中分布在邊緣的殘余液體，加入數(shù)滴甲醇固定［1］，3min后翻轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)板，手指用力按下細胞制片，翻轉(zhuǎn)細胞制片，讓其自然干燥后拍照.按照文獻［2］對細胞面進行瑞氏－吉姆薩染色，最后置玻璃片上于顯微鏡下觀察并拍照.

2 結(jié) 果

從等邊的三邊形到六邊形，制備了4種制片式細胞培養(yǎng)孔（見圖1），每孔底背刻有英文大寫字母和阿拉伯數(shù)字組成的標識，便于區(qū)分每個細胞孔.將其中一個細胞孔底板（標識C1）按下后，翻轉(zhuǎn)后反寫的標識成為正寫（圖2A）.SW480細胞染色后鏡下可見圖片飽滿，層次分明，細胞大小均勻，分布自然，界限分明，形態(tài)完整，沒有皺縮現(xiàn)象.細胞梭形為主，與培養(yǎng)液中細胞大小形狀相同.胞質(zhì)淺蘭紫色，胞核呈現(xiàn)玫瑰紅，位于細胞中央，占大部分面積，少部分細胞核可見明顯濃縮的核塊（圖2B）.

3 討 論

細胞生物學(xué)的發(fā)展，在很大程度上得益于研究技術(shù)的進步，17世紀顯微鏡的發(fā)明開創(chuàng)了這門現(xiàn)代生命科學(xué)的前沿分支學(xué)科［3］，與顯微鏡相關(guān)的細胞培養(yǎng)技術(shù)更是起到了推波助瀾的作用［4］.雖然這些技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到非常高的程度，但仍然存在發(fā)展的空間，尤其是小的技術(shù)方面，有利于不同條件下開展和對高技術(shù)的補充.本文介紹的技術(shù)就屬于這類，是伴隨作者對研究工作的深入，在已經(jīng)研究的細胞制片成果上，能夠把細胞培養(yǎng)與細胞制片完美的結(jié)合起來，不久的將來，能夠使用該商品化的制片式細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)細胞制片操作將上升到一個新的臺階.細胞培養(yǎng)孔底板溝槽結(jié)構(gòu)有利于底板的分離，大寫的英文字母分別依次代表行號，阿拉伯數(shù)字依次代表列號，它們的組合賦予了細胞培養(yǎng)板各個孔獨特的標識（圖1），標識反寫于底板背面，從上往下觀察時成為正讀（圖2A），這樣有利于識別細胞制片的正反面，在染色及其他細胞操作過程中確定細胞面.本文制備使用的六邊形細胞制片，在大部分細胞操作過程中是最方便的，而且六邊形是自然界中最合理的一種幾何結(jié)構(gòu).細胞制片經(jīng)過瑞氏－吉姆薩染色以后（圖2B），效果與前期報道相一致［2］.該研究在制片方式上的改進，不同于前期報道的貼壁細胞培養(yǎng)后進行制片，操作過程中沒有加熱塑料產(chǎn)生有害氣體［1］，是對前期工作的提升和發(fā)展，是新近開發(fā)的一款細胞培養(yǎng)制片技術(shù)產(chǎn)品，且該產(chǎn)品也適用于懸浮細胞培養(yǎng)制片.

［1］方黎祥，劉芳芳，張婷婷，等.一種貼壁培養(yǎng)細胞制片方法［J］.生物學(xué)通報，2010，3（9）：50.

［2］陳功星.貼壁培養(yǎng)細胞簡便染色方法［J］.生物學(xué)通報，2007，42（12）：45.

［3］Botstein D.Technological innovation leads to fundamental understanding in cell biology［J］.Mol Biol Cell，2010，21（22）：3791－3792.

［4］Park T H，Shuler M L.Integration of cell culture and microfabrication technology［J］.Biotechnol Prog，2003，19（2）：243－253.

The Manufacture and Practicality of Cell Culture－Slide Plate

PAN Hui－juan，YIN Hong－ping，CHEN Gong－xing

（Medical Laboratory Center，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

To develop a biotechnological product with integrated functions of cell culture and microscopy slide，the experiment designed and produced on a cell culture plate with 24holes，cultivated the SW480cell，stained and analyzed with Wright－Giemsa.The results show that the technological product can perfectly integrate the cell culture with microscopy slide，which has innovative and practical value.

cell culture；microscopy slide；innovative；practical

Q－33

A

1674－232X（2012）05－0407－03

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.05.005

2012－04－06

杭州市屬高校重點實驗室科技創(chuàng)新項目（20090233T13）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金項目（2009B125）.

陳功星（1966—），男，副教授，博士，主要從事細胞分子生物學(xué)研究.E－mail：chengx＠yahoo.com.cn