腫瘤始發(fā)細胞：抗腫瘤藥物研發(fā)和評價的挑戰(zhàn)與機遇

當代抗腫瘤藥物的研發(fā)始于20世紀的中葉，某些細胞毒素被發(fā)現(xiàn)能用于殺傷高效增殖的腫瘤細胞。從那時起，腫瘤治療的研發(fā)從一開始的基于實踐經(jīng)驗和觀察，發(fā)展成越來越依賴于我們對人類腫瘤生物學(xué)和腫瘤始發(fā)機制的理解。但是，盡管腫瘤治療上的一些進展，對于許多人類腫瘤來說，尤其是具有未分化表型(如基底細胞型乳腺癌)的腫瘤，治療選擇依舊十分有限，且預(yù)后很差。此外，在首次治療后進一步控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移目前仍是一大挑戰(zhàn)。

近年來，在多種人類腫瘤中已有實驗證據(jù)支持腫瘤始發(fā)細胞(通俗的名稱為腫瘤干細胞)的存在。這使得腫瘤層級理論成為腫瘤生物學(xué)中的基本概念，同時也為抗腫瘤藥物研發(fā)提供了一種很有希望的新的細胞靶點。雖然腫瘤干細胞假設(shè)的提出已有數(shù)十年，但這一假設(shè)的許多方面仍需要進一步完善。腫瘤始發(fā)細胞的一個簡短定義是：那些在分離后仍能繼續(xù)生長形成腫瘤的腫瘤細胞(圖1)，這意味著腫瘤始發(fā)細胞只能通過體內(nèi)實驗進行鑒定。從更廣泛的定義來說，腫瘤始發(fā)細胞被視為是處于腫瘤層級中最頂端的細胞，并突出了異常分化在腫瘤形成中的作用。多向的分化潛能可能是腫瘤始發(fā)細胞的一種常見特征，盡管這并不是一種必需的特性。

圖1 腫瘤干細胞假設(shè)和靶向腫瘤始發(fā)細胞的治療方案。根據(jù)腫瘤干細胞假設(shè)，腫瘤細胞具有異質(zhì)性，并且只有腫瘤始發(fā)細胞擁有廣泛增殖、產(chǎn)生分化細胞以及形成新腫瘤的能力。目前已經(jīng)有許多靶向腫瘤始發(fā)細胞的治療方案。消滅這些細胞可以通過抑制存活通路(例如：應(yīng)用磷酸肌醇-3-激酶的抑制劑或白介素-4-特異性單克隆抗體)，或者提高這些細胞對化療藥物的敏感性(如細胞周期測點激酶抑制劑)。腫瘤始發(fā)細胞和大量的腫瘤細胞共有一些存活通路，所以靶向這些通路的藥物既可以消滅腫瘤始發(fā)細胞，也有望對腫瘤細胞直接發(fā)揮殺傷作用。另一種方法是使腫瘤始發(fā)細胞分化(如骨形成蛋白或CD44-特異性單克隆抗體)，這可能是一種成功的治療方案，因為大部分腫瘤都具有有限的增殖潛能。包含在自我更新機制中的發(fā)育信號的抑制(如Wnt、Hedgehog或小環(huán)境通路信號的抑制劑)可能通過兩種機制發(fā)揮作用。另外，抗血管生成治療可能部分通過影響腫瘤始發(fā)細胞的血管微環(huán)境發(fā)揮作用。然而，腫瘤始發(fā)細胞可能存在基因的不穩(wěn)定性，定向祖細胞可以重獲自我更新的能力。靶向腫瘤始發(fā)細胞和殺滅腫瘤細胞的傳統(tǒng)方法，以及靶向周圍微環(huán)境聯(lián)合用藥可能會產(chǎn)生更好的效果。

“腫瘤干細胞”這個詞并不只意味著腫瘤干細胞來源于正常干細胞。根據(jù)不同的腫瘤類型，那些能形成腫瘤的細胞可能是干細胞、祖細胞或是分化的細胞，這需要根據(jù)腫瘤始發(fā)細胞自我更新能力和分化能力進行表型比對來決定。然而，腫瘤始發(fā)細胞的來源能為針對其的腫瘤策略提供線索。例如，殺死腫瘤始發(fā)細胞的同時殺死了正常干細胞，會導(dǎo)致正常再生的缺陷，而破壞正常的祖細胞則不會有那么嚴重的長期問題。另一個關(guān)鍵問題是，腫瘤始發(fā)細胞并不一定是十分稀少的。此外，腫瘤始發(fā)細胞的行為和數(shù)量可以受到不同環(huán)境因素的影響。腫瘤干細胞假設(shè)的基本概念和這些細胞的起源、數(shù)量和活化水平(如增殖率)無關(guān)。應(yīng)用干細胞生物學(xué)的概念來研究腫瘤細胞分群，會為分子藥物靶點和臨床策略帶來啟示。

當前腫瘤治療的失敗往往不是由于缺乏最初的反應(yīng)或是最初治療的失敗，而是由于耐藥性的誘導(dǎo)和治療后腫瘤的復(fù)發(fā)，而腫瘤始發(fā)細胞在這一過程中被認為起到了關(guān)鍵的作用。目前，一個主要的挑戰(zhàn)就是針對腫瘤的復(fù)發(fā)研發(fā)藥物或策略。這篇文章將在回顧腫瘤干細胞假設(shè)的研究現(xiàn)狀后，重點探討抗腫瘤藥物研發(fā)所面臨的挑戰(zhàn)和機遇。

腫瘤干細胞：證據(jù)與爭議

20世紀90年代中期，John Dick和他的同事們應(yīng)用NOD-SCID小鼠模型證實在急性髓性白血病中存在腫瘤始發(fā)細胞。純化的白血病始發(fā)細胞亞群中存在一種染色體移位，這與在母細胞中所發(fā)現(xiàn)的一致。這一重要發(fā)現(xiàn)不僅支持白血病由克隆形成的特征，同時指出了干細胞處于白血病細胞層級的頂端。

對于實體腫瘤而言，類似的研究要相對困難許多。實體腫瘤包含腫瘤細胞和各種各樣的基質(zhì)細胞。在這樣的實體瘤中，打破細胞間的相互作用可能導(dǎo)致失巢凋亡(anoikis)或改變腫瘤細胞的特征。此外，將腫瘤細胞注射入新的小鼠組織常常不能重建出原來實體瘤中腫瘤細胞所處的微環(huán)境。然而，人們應(yīng)用適當?shù)募毎砻鏄酥?，包括CD44、CD24、CD133、EPCAM和ABCB5，已成功地從人乳腺癌、腦瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌和黑素瘤的實體瘤中分離獲得腫瘤始發(fā)細胞。當把這些腫瘤始發(fā)細胞接種到NOD-SCID小鼠中，常能產(chǎn)生與原發(fā)腫瘤相近的表型特征。

這些分離獲得的細胞是否就是患者實體瘤中真正起作用且是唯一的腫瘤始發(fā)細胞呢？這一問題仍存在理論和技術(shù)上的分歧。當前的細胞分離技術(shù)被認為傾向于分離干細胞龕非依賴性的腫瘤始發(fā)細胞，這類似于在正常干細胞進行移植試驗時，處于活化狀態(tài)的細胞常被分選出來。某些用于分選的分子標記可能選擇逃逸免疫系統(tǒng)的細胞，而這也是腫瘤始發(fā)細胞的相關(guān)特征之一。另一方面，許多用于分選的分子標記可以預(yù)測疾病的進程，提示它們還是可用于鑒定出具有重要臨床意義的細胞亞群。

值得注意的是，一些實驗性白血病小鼠模型不符合腫瘤干細胞假設(shè)，提示某些人類的腫瘤并不支持這一模型。然而，由于許多細胞株已經(jīng)喪失了最初來源的白血病細胞的層級結(jié)構(gòu)，一些實驗性小鼠模型可能不能準確地反映出自然發(fā)生的人類腫瘤的異質(zhì)性以及病理性微環(huán)境。同時，有人認為表型特征差異明顯的人類腫瘤細胞群，在接種入免疫缺陷小鼠后，由于小鼠和人的微環(huán)境不同而不能生長。因此，用小鼠腫瘤模型鑒定腫瘤始發(fā)細胞則增加了腫瘤干細胞假設(shè)的可靠性。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以方便地進行細胞系示蹤實驗，克服了移植實驗的不穩(wěn)定和局限性，能夠為腫瘤的發(fā)生及腫瘤層級提供有力的證據(jù)。

盡管從各種不同的研究系統(tǒng)中獲得的大量證據(jù)都傾向于認為存在腫瘤始發(fā)細胞，然而不同患者中腫瘤層級也不盡相同，且不同的腫瘤始發(fā)細胞與干細胞的相似程度也不相同。許多腫瘤還可能存在不同的腫瘤始發(fā)細胞亞群，而另一些則有共同的腫瘤生成細胞且缺乏層級結(jié)構(gòu)簡單。盡管如此，腫瘤干細胞假設(shè)為我們研究各種腫瘤細胞異質(zhì)性、可塑性、和耐藥性提供了新的理論基礎(chǔ)。

用于理解腫瘤特性的系統(tǒng)框架

腫瘤干細胞假設(shè)并不與已確立的腫瘤的克隆演變觀點相矛盾，但是卻提示了腫瘤細胞層級在腫瘤演變過程中的關(guān)鍵作用，并突出了異常分化過程和早期發(fā)育機制在腫瘤形成中的重要性。對腫瘤異質(zhì)性的一個通常的解釋是基因組的不穩(wěn)定性，而后者通過全面系統(tǒng)的腫瘤基因組分析證實是腫瘤的一個普遍特性。另一方面，很大一部分形態(tài)學(xué)或表型上的異質(zhì)性可以用異常分化和表觀遺傳來解釋。腫瘤始發(fā)細胞的行為還可進一步被腫瘤-宿主間的相互作用所改變。在這一節(jié)中，我們將討論腫瘤始發(fā)細胞的一些關(guān)鍵特性。

腫瘤始發(fā)細胞通過提高自我更新能力而有別于其起源細胞

盡管腫瘤始發(fā)細胞的來源可能不同，但是它們具有一些和正常干細胞類似的特征，尤其是自我更新能力。如果腫瘤干細胞假設(shè)是正確的，腫瘤的演變則在很大程度上是自我更新的腫瘤始發(fā)細胞改變的歷史，且在腫瘤始發(fā)細胞中，自我更新的通路較細胞表面分子標志更為保守。

盡管調(diào)控自我更新的通路在正常干細胞中受到嚴格的控制，而在腫瘤始發(fā)細胞中，自我更新持續(xù)性地被激活，并受到基因組和(或)表觀遺傳改變的調(diào)控，最終導(dǎo)致了細胞生長無法控制。一些研究顯示，BMI1和Wnt信號分子β-catenin調(diào)控著造血干細胞(HSC)的自我更新，并且也調(diào)控著白血病始發(fā)細胞的增殖。事實上，許多白血病始發(fā)細胞具有較正常造血干細胞更強的自我更新能力。此外，最近的研究顯示，皮膚腫瘤始發(fā)細胞的維持需要依賴于Wnt和β-catenin信號。Hedgehog信號則調(diào)控著多發(fā)性骨髓瘤和慢性髓性白血病來源的腫瘤始發(fā)細胞。調(diào)控正常干細胞自我更新的發(fā)育相關(guān)信號通路包括Wnt、Hedgehog和Notch，它們在不同腫瘤中也被激活，并可能在許多腫瘤中對其自我更新具有重要的作用。它們對于祖細胞和細胞系的形成具有廣泛的影響，同時對調(diào)控腫瘤和基質(zhì)細胞也具有作用。在這一快速發(fā)展的腫瘤生物學(xué)研究領(lǐng)域，那些能使細胞獲得或增強自我更新能力的機制不斷被發(fā)現(xiàn)，同時一些經(jīng)典的腫瘤基因也被賦予了調(diào)控自我更新的作用。例如，通過獲得某些表觀遺傳的修飾或是失去某幾個腫瘤抑制基因，祖細胞能獲得自我更新能力并變成惡性細胞。

自我更新可以受到增殖、分化或凋亡改變的影響。異常增加的自我更新可能通過不同的機制所形成，如增殖率的增加或是細胞分裂平衡由不對稱分裂移向?qū)ΨQ分裂。急性或慢性髓性白血病的腫瘤始發(fā)細胞大多處于靜息狀態(tài)，而大多數(shù)實體瘤的腫瘤始發(fā)細胞則處于增殖狀態(tài)。乳腺癌或胰腺癌腫瘤始發(fā)細胞的細胞周期特性，與大多無腫瘤形成能力的腫瘤細胞的相類似，顯示出自我更新和腫瘤移植并不一定需要腫瘤始發(fā)細胞具有區(qū)別于非腫瘤始發(fā)細胞的增殖優(yōu)勢。相反，Pten缺失小鼠來源的腸道干細胞增殖緩慢，卻能導(dǎo)致腸道息肉。因此，腫瘤始發(fā)細胞最為重要的特征似乎應(yīng)該是它們自我更新能力的增強，而不是增殖率的增加。事實上，腫瘤始發(fā)細胞克隆演變的過程是對更強的自我更新能力的篩選過程，而不是增殖能力的篩選過程。此外，一個能形成惡性腫瘤的細胞通常具有和增強的自我更新能力相關(guān)的去分化病理特征，包括轉(zhuǎn)移和促血管新生的能力。

腫瘤始發(fā)細胞在轉(zhuǎn)移和腫瘤-宿主相互作用中的角色

一個對腫瘤干細胞假設(shè)的推論是宏觀上的轉(zhuǎn)移可能是由移動的或是彌散的腫瘤始發(fā)細胞所形成的。在乳腺癌患者中，CD44+CD24-/low的腫瘤形成細胞可以在轉(zhuǎn)移性的胸膜滲出液中檢測到，并且大多早期在骨髓中檢測到的彌散性腫瘤細胞都具有乳腺癌始發(fā)細胞的表型。有趣的是，CD133+CXCR4+的腫瘤始發(fā)細胞能在胰腺癌瘤體侵襲前沿被檢測到，研究顯示這些細胞決定個體腫瘤的轉(zhuǎn)移表型。另一個相關(guān)的假設(shè)是，轉(zhuǎn)移性腫瘤起源于那些具有上皮細胞特征的惡性細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)。與自我更新一樣，EMT受到發(fā)育信號通路，如Wnt和Notch的調(diào)控。在乳腺癌始發(fā)細胞中表達腫瘤相關(guān)的microRNA LET7能抑制細胞的自我更新、EMT以及移植性腫瘤轉(zhuǎn)移。最近人們注意到，發(fā)生EMT的細胞和腫瘤始發(fā)細胞具有很多共同的分子標記和特征。這些發(fā)現(xiàn)揭示了腫瘤細胞潛在的可塑能力，并提示EMT和自我更新可能具有一些共同的調(diào)控機制。

干細胞龕微環(huán)境中的輔助細胞和細胞外基質(zhì)復(fù)合物能為正常干細胞提供信號，從而對其行為進行嚴格地調(diào)控。干細胞龕不僅支持著干細胞自我更新和維持其特性，同時還控制著干細胞的數(shù)量和增殖。這種對細胞數(shù)量和增殖的控制可能是一種腫瘤的預(yù)防機制。同樣，我們也可以認為腫瘤的微環(huán)境也能對腫瘤始發(fā)細胞起到抑制作用，例如一些腫瘤可以數(shù)十年處于靜息狀態(tài)或是發(fā)展緩慢。關(guān)于腫瘤靜息的一種理論是腫瘤始發(fā)細胞被干細胞龕-干細胞間的相互作用所監(jiān)控。一旦干細胞龕中微環(huán)境因遺傳或表觀遺傳的改變而發(fā)生改變的話，腫瘤則會進一步地發(fā)展。研究顯示，HSC龕的改變將導(dǎo)致骨髓增生性疾病。腫瘤始發(fā)細胞也更傾向于定位在適合他們增殖的微環(huán)境如血管細胞龕中，或是促進它們自己的細胞龕微環(huán)境的形成。此外，突變能使腫瘤始發(fā)細胞獲得不依賴于細胞龕微環(huán)境的信號，從而擺脫微環(huán)境對其自我更新的調(diào)控，并增加了發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的危險。

為什么許多治療手段不能徹底根除腫瘤？

許多腫瘤患者，尤其是實體瘤患者，要么對目前的腫瘤治療手段(包括化療、放療和腫瘤靶向藥物)不能產(chǎn)生有效的反應(yīng)，要么在初始得到緩解后又迅速復(fù)發(fā)。這些治療失敗的關(guān)鍵原因可能是腫瘤始發(fā)細胞所固有的抗藥性和腫瘤細胞的可塑性，以及治療藥物的無效和(或)腫瘤細胞基因組的不穩(wěn)定性。

研究提示，越是難以治療的腫瘤內(nèi)含有的腫瘤始發(fā)細胞越多。臨床醫(yī)療實踐已為這樣一種聯(lián)系提供了間接的證據(jù)。在腫瘤治療后，往往通過檢查患者的腫瘤來預(yù)測治療的效果。如果腫瘤只含有成熟分化細胞的話，那么通常不會復(fù)發(fā)。然而，如果腫瘤樣本中含有大量的未成熟未分化細胞(其中可能包括大量的腫瘤始發(fā)細胞群)的話，腫瘤則有很大的可能會復(fù)發(fā)，因此需要進一步的創(chuàng)傷性治療。研究顯示，急性髓性白血病細胞中干細胞的比例越高，則預(yù)示著治療后的微量殘留病灶越多，預(yù)后也越差。在黑素瘤中，ABCB5是惡性黑素瘤始發(fā)細胞的標志，在黑素瘤患者中檢測到的ABCB5+腫瘤細胞表現(xiàn)出最原始的細胞表型，并與臨床黑素瘤進程呈正相關(guān)。在乳腺癌中，CD44+細胞的特異性基因包括許多已知的干細胞標志，并與患者生存率降低相關(guān)。此外，化療會提高乳腺癌患者中CD44+CD24-/low細胞的比例，并與這些腫瘤始發(fā)細胞相關(guān)的耐藥性一致。

很多腫瘤始發(fā)細胞被認為能抵抗如paclitaxel和doxorubicin等化療藥物，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因有很多，包括它們本身處于靜息狀態(tài)或生長緩慢，高表達ABC藥物泵，高表達抗凋亡分子，對過氧化及基因損傷的抵抗性，以及它們高效的DNA修復(fù)能力。雖然腫瘤始發(fā)細胞通常較其他腫瘤細胞耐藥的能力更強，但是正如正常干細胞一樣，腫瘤始發(fā)細胞中不同細胞亞群對治療藥物的敏感性也存在著差異。

與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物一樣，許多新型的腫瘤靶向藥物也是針對高速增殖的腫瘤細胞，因此許多腫瘤始發(fā)細胞對這些藥物也相對不敏感。例如，imatinib(Gleevec，Novartis)靶向抑制BCR-ABL激酶，后者是染色體移位產(chǎn)生的融合蛋白，研究提示其能作為一種分子開關(guān)，在慢性髓性白血病中能促進多潛能祖細胞的增殖和分化。BCR-ABL對于處于增殖中的祖細胞的存活是必需的，但是對于靜息的慢性髓性白血病干細胞卻不是必需的。因此，雖然人們認為腫瘤始發(fā)細胞能不斷積累突變，而這些突變產(chǎn)生的功能影響，往往在腫瘤層級中下游的細胞上顯露出來，如導(dǎo)致原始祖細胞的新生性增殖。所以，imatinib能殺滅處于增殖的白血病祖細胞，而非更初始的腫瘤始發(fā)細胞，這也解釋了為什么在接受治療后患者的融合基因表達仍為陽性。IKZF1的變化被認為能協(xié)同增強BCR-ABL融合蛋白誘導(dǎo)淋巴母細胞白血病的作用，并在抗藥性和疾病進展過程中發(fā)揮著一定的作用。盡管其他一些因素可能也參與其中，但是目前的研究顯示，靶向針對維持干細胞所必需的發(fā)育信號通路如Hedgehog，能有效地避免imatinib治療慢性髓性白血病相關(guān)的耐藥和復(fù)發(fā)。也正如先前所討論的，有些腫瘤中的腫瘤始發(fā)細胞可能處于增殖狀態(tài)，且生長信號通路在這些細胞中具有重要作用。因此在這些腫瘤中，相關(guān)的信號通路也可以是非常有希望的治療靶點。

如果患者擁有大量的腫瘤始發(fā)細胞，而僅僅只需要一小部分就能重新產(chǎn)生一個腫瘤，那么只有那些能高效殺死這些細胞的治療手段才能避免其再度復(fù)發(fā)。如果基于腫瘤回縮的檢測，那么能殺死腫瘤中95%細胞的治療就能被認為是一種有效的治療，但是其仍可能使足夠的腫瘤始發(fā)細胞存活下來，并導(dǎo)致最終的再度復(fù)發(fā)。因此，即使腫瘤始發(fā)細胞和其他腫瘤細胞對治療的敏感性相當，它們也依然是影響療效的關(guān)鍵。

如果腫瘤干細胞假設(shè)被廣泛接受，這一理論也可能涵蓋那些較易治療的腫瘤，例如某些生殖細胞腫瘤(如精原母細胞瘤)和神經(jīng)母細胞瘤。事實上，這些腫瘤的化療藥物治療往往能消除去分化的腫瘤細胞，殘留由分化細胞組成的良性腫瘤團塊。這提示它們的干細胞可能本來就對化療藥物敏感，不能很快適應(yīng)并發(fā)展出耐藥性。Trastuzumab(Herceptin；Genetech、Roche)是一種特異性針對受體型酪氨酸激酶ERBB2(也被稱為HER2)的單克隆抗體，最近的一些研究提示，其能提高乳腺癌患者的生存率與其靶向性針對腫瘤始發(fā)細胞有關(guān)。然而，許多轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在Trastuzumab治療1年內(nèi)仍產(chǎn)生了抗藥性，這提示了在基因組及表觀遺傳水平對腫瘤始發(fā)細胞的重塑，能使它們在腫瘤進展及藥物抵抗功能上發(fā)生進一步的演變。靶向針對腫瘤始發(fā)細胞的治療仍不可避免的要面對，在過去幾十年中我們治療其他腫瘤細胞所面對的問題：即新耐藥性的出現(xiàn)和高耐藥細胞群的選擇。然而，研究腫瘤始發(fā)細胞行為的分子基礎(chǔ)，則有利于我們設(shè)計出新的治療策略，如通過聯(lián)合治療來對抗耐藥性。

治療的機遇

腫瘤始發(fā)細胞學(xué)說為超越傳統(tǒng)的抗增殖治療方案提供了理論基礎(chǔ)。消滅腫瘤干細胞潛在的方法包括阻斷這些細胞自我更新的信號，抑制這些細胞存活的機制，抗體毒素連體藥靶向腫瘤始發(fā)細胞表面的標志物，另一種方法是誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，包括通過抑制發(fā)育通路或表觀遺傳程序來達到。有些腫瘤始發(fā)細胞保持其特性可能有賴于一個特定的微環(huán)境，靶向針對這種微環(huán)境來間接抑制或誘導(dǎo)腫瘤始發(fā)細胞的分化也是一種方案。

發(fā)育通路在自我更新和分化中的作用

通常認為腫瘤細胞的異常分化和自我更新的失控是許多癌癥發(fā)生的關(guān)鍵因素，因此一些與發(fā)育有關(guān)的信號通路成了近期抗癌藥物開發(fā)研究的焦點。在胚胎發(fā)育的過程中，有許多相互交聯(lián)的信號通路，信號核心發(fā)出、接收和整合不同的通路。腫瘤始發(fā)細胞及其微環(huán)境發(fā)揮著類似于信號核心的作用，通過它們，許多的發(fā)育通路被激活和匯聚來控制癌細胞自我更新。

在一些腫瘤中，Wnt信號被證實是腫瘤始發(fā)細胞自我更新所必須的，包括慢性髓細胞白血病和鱗癌。細胞外Wnt信號抑制劑，包括存在于細胞表面作用于受體來抑制Wnt的分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRPs)和Dickkopf 蛋白(DKKs)已被發(fā)現(xiàn)。這些拮抗劑的衍生物，如果設(shè)計成具有理想的藥代動力學(xué)特性，就可以形成抗腫瘤的藥物，抑制Wnt信號甚至是在APC或β-catenin突變的腫瘤中。癌源性轉(zhuǎn)錄因子TCF-βcatenin復(fù)合體的小分子拮抗劑已被報道。針對不同Wnts、卷曲蛋白和Wnt共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)-LRP6的抗體也在研究中。

H e d g e h o g信號通路的抑制也是一種治療方案，Hedgehog抗體和Hedgehog共受體光滑同源物(S M O)的小分子抑制劑已被發(fā)現(xiàn)。據(jù)報道，Hedgehog信號抑制劑在諸多動物模型中均有效，其中包括基底細胞癌、成神經(jīng)管細胞瘤、小細胞肺癌和胰腺癌。最近又發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號抑制可以殺傷CML腫瘤始發(fā)細胞，抑制BCR-ABL驅(qū)動的CML的增生和伊馬替尼耐藥的小鼠和人類CML的生長。然而，這些藥物在體外模型上并不十分有效，在細胞模型的結(jié)果也表現(xiàn)出了相當大的差異，部分原因在于傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下導(dǎo)致的分化使得在體外難以維持Hedgehog信號通路的活性，以及(或)基質(zhì)細胞存在的一些必要條件。腫瘤細胞表達的Hedgehog配體也能激活腫瘤基質(zhì)微環(huán)境中的Hedgehog通路。以下將繼續(xù)討論這些復(fù)雜性藥物對腫瘤細胞體外篩選帶來的挑戰(zhàn)。

通過反義核酸技術(shù)來抑制Notch的表達或小分子抑制能分割Notch的γ-分泌蛋白酶，可以抑制體外Notch表達的轉(zhuǎn)化細胞，并在移植瘤模型中有抗腫瘤效果。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種γ-分泌酶抑制劑可以誘導(dǎo)杯狀細胞分化，并且抑制Apc基因突變小鼠的結(jié)腸腺瘤。另一種γ-分泌酶抑制劑可以使腦瘤中的腫瘤始發(fā)細胞減少。然而，由于它對多Notch通路的抑制以及可能對正常干細胞造成的影響，因此γ-分泌酶抑制劑治療的窗口很窄。最近發(fā)現(xiàn)，Notch配體DLL4的選擇性抗體能通過影響血管生成來抑制腫瘤生長而不產(chǎn)生那么多γ-分泌酶抑制劑在動物模型中的相關(guān)毒性。專一Notch受體的拮抗抗體也在研究中。除了發(fā)育信號通路外，其他的很多信號通路對于不同腫瘤始發(fā)細胞的自我更新可能也會很重要。

越來越多的證據(jù)表明，Wnt、Hedgehog和Notch信號之間可能存在相互作用，和別的一些信號也存在著聯(lián)系，例如腫瘤始發(fā)細胞腫瘤細胞或它們的微環(huán)境中產(chǎn)生的骨形態(tài)生成蛋白(BMPs)和各種生長因子等。這些信號匯集在一起產(chǎn)生腫瘤始發(fā)細胞的一些顯著特征，包括自我更新、增殖、存活和分化。在不同的腫瘤中，不同的信號通路如何相互作用來維持自我更新的能力，以及抑制獨立的通路能否使腫瘤始發(fā)細胞分化、抑制或殺滅，仍不甚明了。結(jié)果可能按具體情況和不同的致癌通路的相互作用而異。例如，在T細胞急性淋巴白血病(T-ALL)中，NOTCH1調(diào)節(jié)PTEN磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT通路。這就意味著單用γ-分泌酶抑制劑對有PTEN缺失和AKT激活的T-ALL不可能起到治療作用。在很多情況下，為了選擇性殺傷腫瘤始發(fā)細胞，有必要抑制多條通路。相反，靶向抑制一條特異的發(fā)育通路來促使分化可以作為一種消滅腫瘤始發(fā)細胞更通用的方案。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BMPs可以誘導(dǎo)CD133+惡性膠質(zhì)瘤的腫瘤始發(fā)細胞分化成星形膠質(zhì)細胞，從而在臨床前的模型中顯著減少腫瘤形成的能力。

自我更新的調(diào)節(jié)機制依然不清楚，其中包含著轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳調(diào)控。人們發(fā)現(xiàn)通過組蛋白修飾來調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)的混合型白血病(MLL)融合蛋白，可以重塑已經(jīng)分化的骨髓細胞，激活已經(jīng)失去自我更新能力的細胞。多梳家族蛋白，如表皮同源物增強子2(EZH2)是干細胞可能抑制與分化有關(guān)的基因的必須元素。最近有報道指出，在一小群惡性膠質(zhì)瘤細胞中的BMP受體1B，它的高甲基化與EZH2的活性有關(guān)。EZH2也會影響B(tài)MI1對p16-p19基因座的抑制作用來防止干細胞生長停滯和凋亡。乳腺癌侵襲性基底細胞型能顯著過表達EZH2，導(dǎo)致乳腺癌易感蛋白1型(BRCA1)的下調(diào)。表觀遺傳機制參與不同腫瘤始發(fā)細胞的可能性以及其作為靶向治療的靶點是一個非常熱門的研究話題。

腫瘤始發(fā)細胞的存活機制

盡管我們不大了解不同腫瘤的腫瘤始發(fā)細胞的存活機制，但它們是消滅腫瘤始發(fā)細胞的潛在靶點。某些不同于發(fā)育通路的致癌性通路在一些腫瘤始發(fā)細胞的存活中可能會發(fā)揮一定的作用，但對于細胞分化多能性卻沒有影響。急性髓細胞白血病(AML)的核因子κb(NF-κb)被發(fā)現(xiàn)在原始的AML細胞(被認為是白血病始發(fā)細胞)中有結(jié)構(gòu)性活化，但在正常的造血干細胞(HSCs)中沒有活性。MG-132，一種有抑制NF-κb信號活性的蛋白酶體抑制劑被證明可以誘導(dǎo)有CD34+CD38-的白血病始發(fā)細胞的快速死亡，對正常的CD34+CD38-細胞無影響。一種白介素-4(IL-4)特異性抗體可以減弱CD133-和CD133+結(jié)腸癌細胞的存活力并增加化療的有效性，說明導(dǎo)致各種腫瘤生長的分子通路也可以作為治療靶點來增加腫瘤始發(fā)細胞對細胞毒治療的敏感性。另外，PTEN-哺乳動物雷帕霉素的靶點(mTOR)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化劑3(STAT3)通路的活化是乳腺癌始發(fā)細胞存活和維持所必須的，PI3K通路調(diào)節(jié)存在于骨髓細胞瘤血管周圍小環(huán)境的腫瘤始發(fā)細胞的存活。最近的研究也表明，乳腺癌中的ERBB2除了在大量腫瘤細胞中的假定的作用外，對于維持腫瘤始發(fā)細胞也具有重要的作用。調(diào)節(jié)自我更新的通路與調(diào)節(jié)腫瘤始發(fā)細胞存活的通路如何相互作用還不清楚，盡管最近發(fā)現(xiàn)乳腺癌中NOTCH1可調(diào)節(jié)PTEN-PI3K-AKT通路和ERBB2的表達。

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤在膠質(zhì)瘤始發(fā)細胞放療前后，基因的損傷反應(yīng)首先被激活。用特異性細胞周期檢測點激酶1(CHK1)和CHK2的抑制劑可以逆轉(zhuǎn)CD133+的膠質(zhì)瘤始發(fā)細胞的放療抵抗性。乳腺癌的某些腫瘤始發(fā)細胞比相應(yīng)的非腫瘤源性的細胞含有的活性氧簇(ROS)水平要低。藥理學(xué)減少腫瘤始發(fā)細胞中ROS的清除劑可以顯著增加基因損傷，并提高其對放療的敏感性。另外，周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDNK1A，也被稱為P21)的表達限制了細胞周期循環(huán)，從而限制了DNA的損傷以及維持了白血病始發(fā)細胞的自我更新。這些初步的研究強調(diào)了通過抑制DNA損傷反應(yīng)來克服腫瘤始發(fā)細胞對治療耐藥的可能性。

細胞表面標志物和小環(huán)境相互作用

腫瘤始發(fā)細胞表面的標志物也是重要的靶點，特別是對抗體的治療。表面標志物CD34、CD44、CD133和ABCB5已經(jīng)用于區(qū)分不同類別腫瘤的腫瘤始發(fā)細胞。表面標志物可以反映細胞源性和特異腫瘤始發(fā)細胞的來歷，在不同類別的腫瘤、不同的患者甚至是相同的患者中，都表現(xiàn)出高度的差異。在這些標志物中，CD44在腫瘤發(fā)生中表現(xiàn)出了一些特別的特性；致癌信號如β-連環(huán)素-TCF4和Ras-Raf-細胞外信號相關(guān)激酶(ERK)通路誘導(dǎo)它的表達，同時受到抑癌基因P53的負調(diào)控。大多數(shù)標志物都可以在正常細胞中表達，因此尋找治療窗是個挑戰(zhàn)。然而，白血病始發(fā)細胞和正常的造血干細胞似乎存在顯著表型差異，包括THY1膜糖蛋白、KIT和IL-3受體-a(IL3RA)表達的差異。特別是IL3RA是AML-始發(fā)細胞的特異性表面標志物，而不存在于正常的干細胞表面。

除了結(jié)合相應(yīng)的靶點并抑制靶點依賴的信號傳遞，大多數(shù)治療性單克隆抗體(mAbs)也與免疫系統(tǒng)的元素(如抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)和(或)依賴補體的細胞毒作用)相互作用，使得免疫反應(yīng)成為抗腫瘤機制的一部分。有趣的是，一種針對ABCB5的單克隆抗體在黑素瘤移植瘤模型中的全身用藥可以誘導(dǎo)ABCB5+的惡性黑素瘤始發(fā)細胞中的抗體依賴細胞毒作用，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。一些腫瘤始發(fā)細胞也會表達免疫耐受標志物，使其抵抗機體的免疫攻擊。然而，抗體細胞毒連體藥或同時結(jié)合腫瘤和免疫細胞的基因工程抗體可以在繞開不同的免疫耐受機制直接施加。ABC轉(zhuǎn)運體的活性可以導(dǎo)致腫瘤始發(fā)細胞對許多化療耐藥，但它也可能會使針對這些靶點設(shè)計的藥物變得有效。

靶向腫瘤始發(fā)細胞表面的藥物也可以通過影響微環(huán)境而發(fā)揮作用。骨內(nèi)的(成骨細胞的)微環(huán)境被認為適合正常造血干細胞和AML-始發(fā)細胞的存活。人們發(fā)現(xiàn)黏著分子CD44的特異性單克隆抗體通過阻滯白血病始發(fā)細胞向有利微環(huán)境的運輸和通過分化誘導(dǎo)干細胞，在體內(nèi)能根除人類AML-始發(fā)細胞。血管內(nèi)皮微環(huán)境也與造血干細胞有關(guān)，同時也可能支持白血病始發(fā)細胞的存活。神經(jīng)干細胞被認為存在于血管微環(huán)境，大腦干細胞存在于血管旁微環(huán)境。另外，干細胞樣膠質(zhì)瘤細胞可以促進腫瘤血管生成，說明這些細胞可能有助于創(chuàng)造獨立的小環(huán)境。以上資料表明，微環(huán)境相互作用的信號傳遞可以是雙向的，腫瘤始發(fā)細胞既是一些信號的源頭也是另一些信號的對象。

有必要強調(diào)的是，多數(shù)小環(huán)境相互作用的數(shù)據(jù)都來源于動物模型，它在不同人類組織和腫瘤中的作用還不清楚。然而，腫瘤始發(fā)細胞和脈管系統(tǒng)的關(guān)系使人們聯(lián)想到抗血管生成治療影響腫瘤始發(fā)細胞的血管微環(huán)境，進而把靶向腫瘤始發(fā)細胞和抗血管藥聯(lián)合使用。靶向腫瘤始發(fā)細胞的其他微環(huán)境的治療也值得進一步探究。

治療窗和聯(lián)合治療策略

治療窗一直是抗腫瘤治療手段，包括那些針對腫瘤始發(fā)細胞的靶向治療所必須面對的挑戰(zhàn)。由于腫瘤始發(fā)細胞表現(xiàn)出過度的自我更新活性，因此可能比正常的干細胞對抑制自我更新通路的藥物更為敏感。由于某些腫瘤抑制基因在祖細胞的同時缺失能導(dǎo)致自我更新能力增強的惡性細胞，因此腫瘤始發(fā)細胞的自我更新機制可能和正常干細胞的有所不同。在小鼠中敲除腫瘤抑制基因PTEN，在導(dǎo)致產(chǎn)生白血病始發(fā)細胞的同時卻使正常HSC細胞被清除了。有趣的是，在這個模型中，rapamycin不僅能殺滅白血病始發(fā)細胞，還能使正常HSC細胞恢復(fù)到正常水平。雖然這還沒有在人類腫瘤中得到證實，但是這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了針對腫瘤始發(fā)細胞的治療確實可能有治療窗。最近的研究顯示，Wnt-β-catenin信號通路在維持皮膚腫瘤始發(fā)細胞和惡性人鱗狀細胞癌中發(fā)揮著作用，然而Wnt-β-catenin信號通路對正常表皮穩(wěn)態(tài)的維持卻不是必需的。正如以下要討論的，Ⅰ期臨床試驗顯示患者對SMO拮抗劑GDC-0449耐受較好，這為針對自我更新信號策略的治療窗提供了初步的臨床依據(jù)。

目前已知腫瘤始發(fā)細胞的分子標志(如急性髓性白血病始發(fā)細胞的分子標志IL3RA)是存在的，隨著不同系統(tǒng)腫瘤始發(fā)細胞群得到進一步的鑒定，目前有限的腫瘤始發(fā)細胞分子標志也將得到擴增。由于許多腫瘤始發(fā)細胞來源于祖細胞或部分分化細胞，因此人們預(yù)測其細胞表面分子標志將有別于正常干細胞。又如CD44特異性的單克隆抗體，針對同一靶點不同表位的抗體，由于其藥代和信號不同，也將會有不同的治療窗。

另一個與腫瘤始發(fā)細胞靶向策略治療窗相關(guān)的例子是，在體外及體內(nèi)試驗均觀察到，蛋白酶體抑制劑MG-132聯(lián)合細胞毒性藥物idarubicin能迅速誘導(dǎo)白血病始發(fā)細胞發(fā)生凋亡，而正常HSC細胞卻能繼續(xù)存活。γ-secretase抑制劑可用于抑制Notch信號通路，但其治療窗卻被認為十分狹窄。然而，在小鼠中用脈沖方式給予γ-secretase抑制劑卻能很好的耐受，提示只要有足夠間隔，正常干細胞能在給藥后迅速恢復(fù)，這類似于用細胞毒性藥物的輔助治療方案。因此，基于藥物的藥代動力學(xué)特征，可以通過優(yōu)化給藥劑量和方式擴大其治療窗。

如上所述，包括調(diào)控自我更新和細胞生長在內(nèi)的一些信號通路，共同參與了對腫瘤始發(fā)細胞的調(diào)控。如果有足夠大的治療窗，針對腫瘤始發(fā)細胞中多條特異性活化的通路將要比抑制某一條通路有效的多。據(jù)報道用cyclopamine和gefitinib同時阻斷Hedgehog和EGFR信號通路，能導(dǎo)致前列腺癌細胞生長停滯、凋亡以及侵襲力下降。PI3K-AKT通路能部分通過控制蛋白激酶A介導(dǎo)的Gli活性來調(diào)控Hedgehog通路，這提示了聯(lián)合Hedgehog拮抗劑和PI3K-AKT抑制劑的潛在治療價值。

許多靶向腫瘤始發(fā)細胞的藥物也能促進這些細胞的分化，因此可能需要聯(lián)合化療殺滅那些分化后處于較低細胞層級的腫瘤細胞。用arsenic trioxide抑制早幼粒細胞白血病蛋白(PML)能打破慢性髓性白血病始發(fā)細胞的穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)分化，促使靜息腫瘤細胞進入細胞周期，并使它們對于促凋亡刺激更為敏感。此外，在成神經(jīng)管母細胞瘤的模型中，PI3K通路能調(diào)控放療后在血管細胞周圍的腫瘤始發(fā)細胞的存活，抑制AKT信號能使這些細胞對于放療更為敏感。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤始發(fā)細胞中，PI3K-AKT信號通路調(diào)控ABCG2的活性，這為我們提供了一個將PI3KAKT抑制劑和那些能被ABC藥物泵轉(zhuǎn)運的化療藥聯(lián)合使用的理由。

基于Notch和Hedgehog信號通路在腫瘤基質(zhì)及腫瘤血管系統(tǒng)中的作用，針對這些信號通路的藥物可能在腫瘤始發(fā)細胞和腫瘤血管兩個方面發(fā)揮作用，同時也需要考慮這些藥物對給藥效率等方面帶來的影響。毫無疑問，聯(lián)合靶向藥物和傳統(tǒng)的化療或放療來對抗腫瘤始發(fā)細胞，不僅能相對任何一種單獨治療更有效地殺傷細胞，同時還能延緩耐藥性的產(chǎn)生。然而，目前尚缺乏足夠臨床前的依據(jù)。

在細胞層級的概念下應(yīng)用分子標志來評價不同的藥物及聯(lián)合治療策略，對于評估它們的療效及在臨床前試驗中研究耐藥性是十分重要的。同樣重要的是，我們需要研究它們對基質(zhì)細胞和血管系統(tǒng)的作用，關(guān)注不同聯(lián)合用藥的治療窗。我們希望能在相關(guān)臨床前模型中獲得的數(shù)據(jù)上，設(shè)計出切實有效的聯(lián)合用藥策略，使其能克服信號通路的替代性補償和可能產(chǎn)生的耐藥性，從而對在臨床上長效緩解腫瘤有所幫助。

腫瘤始發(fā)細胞靶向藥物的研發(fā)

常規(guī)抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)途徑是針對細胞增殖而非自我更新和(或)分化，因此常偏重于選擇針對同質(zhì)表達模式的靶標及可有效殺滅大部分腫瘤細胞的化合物。此外，一些傳統(tǒng)臨床前模型不能反映臨床復(fù)雜性，如腫瘤層級和異質(zhì)。腫瘤始發(fā)細胞依賴于微環(huán)境和發(fā)育通路，包括旁分泌或近分泌信號通路，因而需要更復(fù)雜精確的藥物發(fā)現(xiàn)平臺，而非傳統(tǒng)上曾用于研究腫瘤中自治腫瘤細胞及自分泌信號特征的二維組織培養(yǎng)或皮下接種模型。大量支持腫瘤干細胞假說及相關(guān)治療策略的證據(jù)表明，需要抗癌藥物發(fā)現(xiàn)平臺的調(diào)整以增強其臨床相關(guān)性。

腫瘤始發(fā)細胞富集和體外培養(yǎng)條件

分離腫瘤始發(fā)細胞的來源包括原發(fā)腫瘤患者的樣品、原發(fā)腫瘤接種以及某些腫瘤細胞系。令人感興趣的是，類似于原發(fā)腫瘤細胞，一些常規(guī)條件下培養(yǎng)的惡性腫瘤細胞具有基于確定的腫瘤始發(fā)細胞標志物的腫瘤分級。盡管它們與來自原發(fā)患者樣品的腫瘤始發(fā)細胞的相關(guān)性尚待進一步研究，發(fā)現(xiàn)某些惡性腫瘤細胞株可能含有腫瘤始發(fā)細胞亞群仍屬重要：細胞系可提供足夠材料來研究這些細胞的分子特征和信號通路。

腫瘤始發(fā)細胞的富集有若干途徑：使用細胞表面標志物的細胞分類法、染料細胞亞群的分類法，或使用各種無血清干細胞培養(yǎng)條件。盡管細胞表面標志物細胞分類法可用于分離表達確定標志物的腫瘤始發(fā)細胞，但用在缺乏標志物和(或)多種標志物的其它腫瘤則甚具挑戰(zhàn)性。

編碼ABC藥物轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達如ABCG2是某些干細胞群的保守特征，D N A 結(jié)合染料Hoechst33342的釋放已用于鑒定和富集某些類型的腫瘤始發(fā)細胞。理論上，該法更適合用于富集潛在的腫瘤始發(fā)細胞，因為與前述的細胞表面標志物法相比，它更少受組織特異性限制。然而，染料排出動力學(xué)、染料清除所致的干細胞毒性可能限制富集細胞群的功能分析。另外也可能通過選擇干細胞的其它替代功能屬性來富集腫瘤始發(fā)細胞，例如醛脫氫酶活性和化療耐藥性。

無血清的非貼壁培養(yǎng)已用于富集和繁殖數(shù)種腫瘤始發(fā)細胞，包括來源于腦、乳腺和大腸惡性腫瘤的細胞。無血清“球狀”培養(yǎng)法由中樞神經(jīng)細胞培養(yǎng)發(fā)展而成。生長在非貼壁表面的中樞神經(jīng)細胞形成球狀集落(神經(jīng)球)，具有自我更新能力并可分化產(chǎn)生腦部所有主要的細胞類型(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突細胞)。與之相比，無血清貼壁培養(yǎng)的細胞仍保持類干細胞性質(zhì)，特別是所用培養(yǎng)皿使用特定表面(例如整合各種含氮功能基團)或涂上合適的基質(zhì)和(或)配體的話。

發(fā)展模擬微環(huán)境所提供的生長和抑制分化信號的培養(yǎng)方法及條件至關(guān)重要，尤其是培養(yǎng)原發(fā)腫瘤細胞。已用于正常干細胞的無血清培養(yǎng)條件可以提供有用借鑒。新一代高通量平臺，如細胞外基質(zhì)或其它參與旁分泌和近分泌信號的微陣列技術(shù)可用于鑒定不同腫瘤始發(fā)細胞的相關(guān)微環(huán)境信號。在無血清培養(yǎng)條件下維持和擴增正常干細胞的成功方法包括激活Wnt、Hedgehog和(或)Notch通路以及抑制BMP通路。恰當?shù)纳L因子，而適宜的微環(huán)境，如層黏連蛋白鋪底的培養(yǎng)皿或富含層黏連蛋白的基質(zhì)可能是必須或有幫助的條件。代謝活性和氧張力是干細胞和腫瘤始發(fā)細胞培養(yǎng)中需要考慮的其它因素。

除了考慮合適的篩選終點，這些干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)腫瘤始發(fā)細胞時需考慮這些細胞的獨特起源及特性。調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)中自我更新的發(fā)育信號通路亦可提供靶點，因此外源性因素的平衡對某些篩選可能至關(guān)重要。與正常干細胞不同，腫瘤始發(fā)細胞一般帶有可改變其對生長因子依賴性或反應(yīng)性的突變。腫瘤始發(fā)細胞起源或特性為類祖細胞時，培養(yǎng)條件可能需要進一步改變。最后，腫瘤始發(fā)細胞的突變和通路特征可能因腫瘤亞型和分級而不同，因此細胞培養(yǎng)條件可能不得不需要隨之優(yōu)化。

體外分析及篩選方法

在多種情況下，包括球狀培養(yǎng)條件下，腫瘤始發(fā)細胞體外培養(yǎng)會產(chǎn)生腫瘤始發(fā)細胞和分化細胞子代混合群。這既是挑戰(zhàn)(分離實驗干預(yù)對腫瘤始發(fā)細胞的效應(yīng))也是機會(可使用分化作為終點)。使用免疫熒光或熒光報告基因表達監(jiān)測干細胞標志物可經(jīng)得起高通量分析的檢驗，已成功用于胚胎干細胞自我更新的新型調(diào)節(jié)因子篩選。分化標志物也已用于篩選驅(qū)動或抑制干細胞分化的小分子或基因。在這些成功的基礎(chǔ)上，不難想象出調(diào)制腫瘤始發(fā)細胞行為的成像平臺和其它以標志物為基礎(chǔ)的篩選平臺。然而，如何從圖像中獲得有效可信的定量數(shù)據(jù)則是對數(shù)據(jù)搜集、處理和圖像處理的挑戰(zhàn)。另一個挑戰(zhàn)是幾乎無明確的能用于所有腫瘤始發(fā)細胞及其分化子代的標志物和報告基因。

最終，體內(nèi)的腫瘤-宿主間相互作用和腫瘤-基質(zhì)相互作用的復(fù)雜性可能通過三維器官培養(yǎng)混合細胞群而得以更好的重現(xiàn)，其可維持體內(nèi)腫瘤-宿主相互作用，也可能富集腫瘤始發(fā)細胞。一種更為成功的體外篩選方案可能使用混合三維器官培養(yǎng)，使用多種標志物或內(nèi)建的定量熒光或酶報告蛋白對其中的腫瘤始發(fā)細胞進行定量并追蹤。三維培養(yǎng)篩選的一個挑戰(zhàn)是高產(chǎn)模式下器官結(jié)構(gòu)的一致性，然而可靠的胚胎干細胞擬胚體產(chǎn)生的集結(jié)法或可應(yīng)用于此。三維培養(yǎng)模式下特定細胞群定量可聯(lián)合使用高速成像系統(tǒng)及自動圖像分析技術(shù)。

白血病起始化細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤始發(fā)細胞的體外分析條件已經(jīng)取得了進展，高通量體外分析搜索殺滅或分化這些細胞的化合物已經(jīng)可行。此外，對造血系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細胞和祖細胞的深入理解使得這些組織的正常干細胞和腫瘤始發(fā)細胞可以直接進行比對。其它腫瘤始發(fā)細胞的類似分析終將建立并優(yōu)化。

理想的培養(yǎng)條件應(yīng)支持腫瘤細胞體外增殖、無基因型改變并保留表型特征——最重要的是傳代后體內(nèi)致瘤性。然而，即使短期培養(yǎng)也可造成具有相同細胞表面標志物的造血干細胞體內(nèi)增殖能力改變，提示對體外結(jié)果不應(yīng)草率下結(jié)論。另一種替代方法是應(yīng)用遺傳工程達到穩(wěn)定的癌細胞間質(zhì)樣狀態(tài)，可捕獲許多腫瘤始發(fā)細胞性質(zhì)以進行體外高通量篩選，最近應(yīng)用該法已獲得針對腫瘤始發(fā)細胞的新線索。

體內(nèi)腫瘤模型

要評估腫瘤始發(fā)細胞特異性靶向藥物，必須高度關(guān)注植入成瘤細胞前后藥物對腫瘤起始化活性的影響；對已生成腫瘤的效果可能不如初期腫瘤那么明顯，治療時間可能需要較長。替代終點包括對化療后復(fù)發(fā)的療效、對轉(zhuǎn)移的效果以及治療后殘余瘤細胞重新用于體內(nèi)種植模型的再種植能力。然而，腫瘤始發(fā)細胞在實體瘤中出現(xiàn)的頻率遠高于白血病腫瘤始發(fā)細胞，而最近的數(shù)學(xué)分析進一步提示腫瘤始發(fā)細胞在晚期腫瘤中不會只占一小部分。數(shù)學(xué)模型預(yù)測，如果祖細胞獲得自我更新能力，那么自我更新始細胞將在腫瘤中占據(jù)多數(shù)地位。因此，腫瘤始發(fā)細胞靶向藥物可能對某些傳統(tǒng)的但含有大量腫瘤始發(fā)細胞的晚期腫瘤模型具有顯著效果。

腫瘤始發(fā)細胞原位重植可能是評價該細胞功能的更有效方式，而腫瘤轉(zhuǎn)移到特定器官的過程?？捎迷荒Ｐ驮佻F(xiàn)。在許多上皮腫瘤中，其侵襲性邊緣會發(fā)生明顯EMT或去分化，并可能介導(dǎo)細胞失黏附及最終的轉(zhuǎn)移。發(fā)生EMT的細胞可看作轉(zhuǎn)移性腫瘤始發(fā)細胞的前體，因此EMT標志物可用作評價轉(zhuǎn)移模型中腫瘤始發(fā)細胞靶向藥物的生物標志物。盡管原位模型的地位日益提升，但某些腫瘤(如結(jié)腸癌)的原位植入甚為困難。在此情況下，已探索若干替代方法，包括皮下模型植入細胞用人工基質(zhì)重懸(或混入基質(zhì)細胞)的癌細胞以及腎包膜下移植。

體內(nèi)藥物的發(fā)現(xiàn)篩選需要一個可再生的、成本效益比較好的系統(tǒng)。涉及原發(fā)腫瘤異位種植的腫瘤始發(fā)細胞模型在中或高通量分析方面有所受限，這是由于腫瘤固有變異性以及需使用新鮮切除材料的操作實際造成的，但這類模型仍可作為一個選擇，用于測試候選藥物。另一個替代方法是產(chǎn)生富集腫瘤始發(fā)細胞的癌細胞系。一個高度惡性的乳腺癌細胞系(SK-3rd)在NOD-SCID小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)成功，該小鼠使用表柔比星處理后發(fā)生對化療耐藥的腫瘤始發(fā)細胞對化療抵抗。SK-3rd細胞系富集了具有乳腺癌腫瘤始發(fā)細胞所有公認特征的細胞；而且這些細胞可發(fā)生轉(zhuǎn)移，具有連續(xù)移植能力。最近，直接分離自原發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤的膠質(zhì)瘤起始化細胞系成功培養(yǎng)并在無血清貼壁培養(yǎng)條件下擴增。遺傳工程方法亦可應(yīng)用在癌細胞系以產(chǎn)生未分化及致瘤性特征。與常規(guī)癌細胞系相比，這些細胞系的臨床相關(guān)性可能更高，盡管從中獲得的任何結(jié)果均需在原發(fā)癌細胞中進行驗證。

與細胞系和原發(fā)腫瘤細胞研究的限制性相比，經(jīng)過體內(nèi)傳代的人源腫瘤模型為臨床前模型提供了獨特的研究腫瘤異質(zhì)性和層級的系統(tǒng)。外科手術(shù)切除的腫瘤組織直接種植到免疫缺陷小鼠(原位或皮下)；種植物再傳代至新鼠，因此保持絕對體內(nèi)傳代。原發(fā)人源腫瘤種植的細胞結(jié)構(gòu)和異質(zhì)性與患者原始腫瘤高度一致，其特征比傳統(tǒng)細胞株種植更為復(fù)雜。因而，原發(fā)腫瘤種植聯(lián)合恰當?shù)膶嶒灧治龉ぞ弑憬⑵鹨粋€易于管理的臨床前人源模型，可有效評估先導(dǎo)化合物、研發(fā)藥物聯(lián)用及生物標志物策略。

體內(nèi)生物標志物及影像研究

如果腫瘤始發(fā)細胞僅代表腫瘤內(nèi)部一個細胞亞群，其存在依賴于微環(huán)境，那么便值得在治療期內(nèi)對其進行追蹤，對相應(yīng)環(huán)境組分進行可視化研究。對腫瘤層級的試驗干預(yù)和腫瘤-宿主相互作用效應(yīng)的初步理解可采用免疫組織化學(xué)法，使用抗腫瘤始發(fā)細胞、EMT、世系分化和不同基質(zhì)細胞的標志物抗體。對含有大量腫瘤始發(fā)細胞的腫瘤模型，基因標記和芯片技術(shù)可提供腫瘤始發(fā)細胞的生物標志物。通過對結(jié)合不同熒光染色劑的黑素瘤細胞進行體內(nèi)家系跟蹤，對共同種植的ABCB5+黑素瘤起始化細胞和ABCB5-亞群進行檢測，分析其對腫瘤生長、自我更新和分化的相對貢獻，而治療效果大體上也可按照類似方法進行研究。當前并無良法進行直接成像，盡管使用腫瘤始發(fā)細胞的特異性標記抗體可能提供一個切入點。評價腫瘤始發(fā)細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，可使用磁共振對磁能標記的腫瘤始發(fā)細胞進行成像，該法已用于正常干細胞的研究。同時，也值得開發(fā)替代報告基因或其它生物傳感器，用來對自我更新信號和腫瘤始發(fā)細胞進行體內(nèi)監(jiān)測。報告基因靶向釋放早已應(yīng)用于正常造血干細胞，可使用動物活體成像儀進行定位和監(jiān)測。更多具備腫瘤干細胞樣特征的標志物和報告基因正有待開發(fā)。

具有前景的是，依照腫瘤干細胞假說對抗癌藥物發(fā)現(xiàn)平臺的改進將改善臨床前試驗和模型的臨床相關(guān)性。這些模型不僅有助于理解當前化療和腫瘤靶向藥物如何影響不同水平的腫瘤層級，還會發(fā)現(xiàn)新的腫瘤始發(fā)細胞靶向藥物。此外，使用這些模型的臨床前研究可提供數(shù)據(jù)以支持獨特的腫瘤始發(fā)細胞靶向藥物的臨床聯(lián)合治療及生物標志物方案。

臨床對策及展望

與癌癥預(yù)后不良相關(guān)異常分化的許多方面可用腫瘤干細胞假說進行解釋。該假說得到晚期癌癥臨床試驗的事實支持，即腫瘤消退常常無法轉(zhuǎn)化為臨床患者生存期的顯著延長。微小殘留病灶、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)延遲及無瘤生存的療效預(yù)期與以腫瘤始發(fā)細胞為目標、以機制為基礎(chǔ)的藥物活性相關(guān)。

如果腫瘤消退不是最相關(guān)的早期終點，則需針對接受抗癌治療的患者進行腫瘤始發(fā)細胞的生物標志物研發(fā)。然而，將在腫瘤始發(fā)細胞中富集的標志物轉(zhuǎn)化為臨床生物標志物并非坦途。例如，通過免疫組織化學(xué)檢測CD44+CD24-/low在乳腺癌患者中的表達與無病或整體生存并無相關(guān)性，提示并非所有的CD44+CD24-/low癌細胞均有致瘤性，細胞表面標志物可能不如起初所想的那樣保守。然而，通過比對CD44+CD24-/low乳腺癌細胞與正常乳腺上皮細胞獲得的基因標簽與患者生存期降低相關(guān)，該標簽可能反映腫瘤細胞的表觀遺傳狀態(tài)。循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細胞雖然極其稀有，但可作為侵襲性活檢的潛在替代腫瘤組織源，間接用于對實體腫瘤中的腫瘤始發(fā)細胞進行檢測、鑒定及監(jiān)控。一種基于微流體學(xué)的微芯片技術(shù)具有足夠的敏感度，可在絕大部分復(fù)發(fā)癌患者中檢測出循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細胞。

現(xiàn)有標志物與腫瘤始發(fā)細胞的相關(guān)度研究也很重要，如用于診斷前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)和診斷卵巢癌的黏蛋白16(MUC16；又名CA125)，如今已用于指導(dǎo)臨床試驗及治療。PSA和MUC16在分化腫瘤細胞中均有表達；現(xiàn)仍不清楚它們是否僅限于在大塊腫瘤細胞群表達還是也可見于腫瘤始發(fā)細胞群中。如果遺傳學(xué)(如基因擴增)或表觀遺傳學(xué)(如啟動子甲基化)改變或相關(guān)通路多發(fā)改變可用于預(yù)測腫瘤始發(fā)細胞對某些癌基因通路的依賴性，一些自我更新信號分子則可能直指癌癥要害。單用這類通路的抑制劑即可能產(chǎn)生顯著的抗癌效果。就此而言，使用這些遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)指標進行病人預(yù)篩檢對藥物研發(fā)至關(guān)重要。

在眾多針對自我更新通路的藥物中，靶向Hedgehog通路的小分子藥物在早期臨床研究中已展開，并且顯示出較有前景的成果。在受試的所有4例患者中，使用SMO拮抗劑環(huán)巴胺使基底細胞癌得以迅速消退。此外，在一項Ⅰ期臨床試驗中，口服劑型SMO小分子拮抗劑GDC-0449在顯示出有限毒性的同時，對晚期基底細胞癌腫瘤部分有效。如今，該藥物已進入結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和其它晚期上皮腫瘤的Ⅱ期臨床試驗。大部分基底細胞癌患者具有Hedgehog通路組分基因突變；尚不明了GDC-0449是否對其它不具有此類突變的腫瘤同樣有效，是否必須聯(lián)合其它藥物才能顯示臨床療效。這種聯(lián)合用藥方法的考量會隨著Hedgehog信號通路在腫瘤基質(zhì)細胞中日益揭示的作用而愈加復(fù)雜。GDC-0449和其它SMO拮抗劑將可為針對自我更新信號通路的臨床對策提供試驗機會。

臨床研究中有若干腫瘤始發(fā)細胞表面標志物抗體。EPCAM在眾多實體腫瘤中表達，近期研究顯示其在乳腺、前列腺、結(jié)腸和胰腺癌的腫瘤始發(fā)細胞中高表達。EPCAM特異性單克隆抗體在臨床試驗中的療效有限，提示在臨床條件下，免疫耐受或單純這些抗體激發(fā)的ADCC不足以有效殺滅EPCAM過表達的腫瘤細胞。為克服裸抗體應(yīng)用的限制，catumaxomab被設(shè)計來連接人EPCAM(腫瘤靶標)和人CD3(T細胞靶標)，從而將癌細胞拉近可殺死它們的免疫細胞。此外，catumaxomab可誘導(dǎo)ADCC，正在進行惡性腹腔積液患者的晚期試驗。作為不同機理，抗CD44單克隆抗體可分化腫瘤始發(fā)細胞，在某些臨床前模型中具有單藥療效。在臨床條件下，這些單克隆抗體是否具有單獨療效，是否需要結(jié)合細胞毒療法，仍有待觀察。

某些針對腫瘤始發(fā)細胞研發(fā)的藥物篩選平臺已開始運行鑒定新藥線索。在短期和長期臨床治療終點，單純腫瘤始發(fā)細胞靶向治療是否有效可能取決于大塊腫瘤細胞的壽命及其所引發(fā)的癥狀。對于大部分細胞壽命較短或腫瘤始發(fā)細胞數(shù)量多的腫瘤，持續(xù)細胞生長可能高度依賴腫瘤始發(fā)細胞的活性。即使腫瘤始發(fā)細胞被消滅，以增殖期類祖細胞為主的腫瘤也可能需要較長時間才能消退。對于某些腫瘤，即使實體腫瘤細胞有限但明顯地持續(xù)增殖也足夠?qū)е虏豢赡娴牟±砀淖?。殺滅所有具備致病潛能的癌細胞是必要的，尤其是幾乎沒有層級結(jié)構(gòu)的腫瘤。遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)不穩(wěn)定性也可能干擾腫瘤初始化細胞靶向藥物的療效。腫瘤初始化細胞靶向藥物聯(lián)合減少腫瘤體積的常規(guī)藥物可能是重要手段，最佳聯(lián)合方式可能依賴于藥物治療窗、多數(shù)細胞壽命及特定細胞類型的腫瘤層級穩(wěn)定性和性質(zhì)。

理解當前部分有效的化療和腫瘤靶向藥物如何影響不同水平的腫瘤分級需要開展更多的工作。如前所述，從臨床前研究已經(jīng)得到一些聯(lián)合治療方案。未來，包括針對腫瘤始發(fā)細胞的細胞毒和腫瘤靶向藥物聯(lián)合治療將把目標同時或序貫投向腫瘤初始化細胞、快速增殖腫瘤細胞及其微環(huán)境(圖1)。期待這種新治療策略可快速消除腫瘤細胞亞群并避免腫瘤始發(fā)細胞或獲得自我更新活性的原本分化細胞導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)。盡管研發(fā)腫瘤始發(fā)細胞的靶向藥物并非一帆風順，但腫瘤干細胞假說提供了藥物發(fā)現(xiàn)和癌癥治療的重要框架，可據(jù)此發(fā)現(xiàn)新的抗癌方法，對未分化的表型癌產(chǎn)生影響，并為眾多癌癥患者帶來長期的獲益。

[英文原文] Zhou BB, Zhang H, Damelin M, et al. Tumour-initiating cells： challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov, 2009, 8(10)：806-823.