李小鷗， 黃 巍， 陳亞雋， 周麗榮

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科，湖北 武漢430070;2武漢市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，湖北 武漢430032 3華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢430030)

神經(jīng)型鈣黏蛋白(neural cadherin，N－cadherin)是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間黏附反應(yīng)的重要媒介，對維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)起重要作用。N－cadherin 與連環(huán)蛋白(catenins)形成N－cadherin/catenins 復(fù)合體(鈣－連復(fù)合體)可使N－cadherin 集中定位細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸部位，該復(fù)合體任何一種成分異常都會影響到N－cadherin 介導(dǎo)的細(xì)胞黏附功能。

基于對N－cadherin 加工代謝過程的深入了解，現(xiàn)已在成纖維細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)N－cadherin 有一條非常重要的解整合素金屬蛋白酶家族ADAMs(a disintegrin and metalloproteinase proteins)加工途徑，ADAMs 在N－cadherin 胞外域N 端的R714－I715處將其水解，破壞了N－cadherin 的分子完整性，影響了鈣－連復(fù)合體的形成，導(dǎo)致其功能喪失并引發(fā)相應(yīng)的病理生理改變［1－2］。研究表明在成纖維細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中，N－cadherin 的ADAMs 加工途徑對相應(yīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮起關(guān)鍵作用［2］，參與上述加工途徑的蛋白水解酶主要是ADAM 家族中的ADAM9、ADAM10 和ADAM17，特別是ADAM10 發(fā)揮了尤為重要的作用［3］。但是心肌細(xì)胞中ADAMs 和N－cadherins 相互作用的研究僅是開始，很多問題尚不清楚，本研究將靶向沉默ADAM10 的siRNA 表達(dá)載體導(dǎo)入大鼠心肌細(xì)胞，并建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，通過觀察該載體對細(xì)胞N－cadherin 的ADAMs 加工途徑的影響，以明確心肌細(xì)胞中ADAM10 在N－cadherin 底物加工過程中的重要性，目的是為探求該加工途徑在維持心肌組織結(jié)構(gòu)形態(tài)和完整性中的作用打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

大鼠ADAM10 干擾載體［sc－270165 ADAM10 siRNA(r)］購自Santa Cruz，兔抗ADAM10 抗體購自eBioscience，兔抗N－cadherin 抗體購自Abcam，AP 標(biāo)記羊抗兔抗體購自Santa Cruz。嘌呤霉素購自Sigma。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 為Invitrogen 產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。液氮中取出H9C2 細(xì)胞，37 ℃水浴化凍，快速放入含10%胎牛血清、0.5% 青鏈霉素的MEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，生長至90% 密度時傳代，轉(zhuǎn)染前1 d 換無抗生素的培養(yǎng)液過夜。

2.2 建立穩(wěn)定表達(dá)的H9c2 細(xì)胞株 轉(zhuǎn)染前1 d 取對數(shù)生長期的H9c2 細(xì)胞以2 ×105cells/well 的密度接種于24 孔板。無抗生素MEM 培養(yǎng)液(10%FBS)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁生長達(dá)80%～90%融合時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1 次，然后按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 的說明書將提取并純化的sc－270165 ADAM10 siRNA(r)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4 h 更換培養(yǎng)液，用含5 mg/L 嘌呤霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h 觀察瞬時表達(dá)情況，3 ～4 d 后當(dāng)對照組細(xì)胞大部分死亡時，根據(jù)嘌呤霉素最小致死濃度實驗，改用3 mg/L 的嘌呤霉素維持篩選，每2 ～3 d 換液傳代，2 周后抗性克隆初步形成。在細(xì)胞融合達(dá)80%時，將細(xì)胞移至6 孔板培養(yǎng)，篩選單克隆至培養(yǎng)瓶中擴增，并在細(xì)胞的對數(shù)生長期收集細(xì)胞，進(jìn)行各項實驗。

2.3 Western blotting 檢測ADAM10 蛋白的表達(dá) RIPA 法提取轉(zhuǎn)染組和空白對照組細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。50 μg 總蛋白進(jìn)行10% SDS－PAGE 電泳，300 mA 2h 轉(zhuǎn)至NC膜。NC 膜經(jīng)5%脫脂奶粉的TBS－T 溶液室溫封閉2h 后，與兔抗鼠ADAM10 抗體(1∶600)4 ℃孵育過夜。TBS－T 溶液洗膜3 次后，NC 膜與HRP 標(biāo)記羊抗兔II 抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBS－T 溶液再次漂洗3 次后ECL 化學(xué)發(fā)光觀察。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。實驗重復(fù)3 次。

2.4 Western blotting 檢測N－cadherin 及其C 末端片段(Cterminal fragment，CTF) I 抗為兔抗N－cadherin 的多克隆抗體，抗原識別表位針對N－cadherin 的C 端，也識別CTF，其余方法同2.3。

2.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測心肌細(xì)胞跨膜表達(dá)的N－cadherin

用PBS 將上述離心后的細(xì)胞吹打下來，再用PBS 洗2 次后，加入以PBA(含10%BSA)1∶100 稀釋的抗N－cadherin 抗體，4 ℃作用1 h，PBS 洗2 次，加入1∶60 稀釋的熒光II 抗，4 ℃作用1 h，PBS 洗2 次，細(xì)胞懸浮0.5 mL PBS，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測N－cadherin。

2.6 心肌細(xì)胞黏附實驗 每孔100 μL 纖維連接蛋白(10 mg/L)包被96 孔板，以100 mg/L 多聚賴氨酸和1%牛血清白蛋白包被孔作為最大和最小黏附參照。將空白對照組和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組細(xì)胞分別制備成5 ×108cells/L 細(xì)胞懸液，每孔加入100 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育3 h。磷酸鹽緩沖液洗滌除去未黏附細(xì)胞，多聚甲醛固定，1% 亞甲藍(lán)溶液染色20 min，每孔加入100 μL 1 mol/L HCl，37 ℃40 min，酶標(biāo)儀測定600 nm 處吸光度(A)，細(xì)胞黏附率(%)= (實驗組A 值－牛血清白蛋白孔A 值)/(多聚賴氨酸孔A 值－牛血清白蛋白孔A 值)×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立

脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染H9c2 細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。Western blotting 檢測ADAM10 蛋白的表達(dá)，見圖1。結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染ADAM10 siRNA 細(xì)胞的ADAM10 蛋白水平降低了75.2%。表明本實驗所用的siRNA能有效而特異地沉默ADAM10 基因，抑制其蛋白表達(dá)。

Figure 1. Expression of ADAM10 protein detected by Western blotting.圖1 轉(zhuǎn)染組與對照組ADAM10 蛋白的表達(dá)

2 Western blotting 檢測細(xì)胞N－cadherin 及其CTF 蛋白表達(dá)

Western blotting 檢測ADAM10 siRNA 轉(zhuǎn)染組和對照組N－cadherin 及其CTF 蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中N－cadherin蛋白的表達(dá)較正常細(xì)胞明顯增多，CTF 蛋白表達(dá)明顯減少，見圖2。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞表面N－cadherin 表達(dá)的變化

陰性對照組N－cadherin 的表達(dá)為(42.23 ±2.52)%，轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞表面N－cadherin 的表達(dá)為(73.48 ±3.41)%，與對照組相比明顯增多(P ＜0.05)。

Figure 2. The expression of N－cadherin and its C－terminal fragment (CTF)detected by Westem blotting. * P ＜0.05 vs control.圖2 N－cadherin 及其CTF 的蛋白表達(dá)

4 細(xì)胞黏附實驗

陰性對照組細(xì)胞黏附率為(40.21 ±4.50)%，ADAM10 siRNA 轉(zhuǎn)染組為(60.23 ±6.50)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，表明轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞黏附率較對照組明顯升高。

討 論

眾所周知，閏盤是心肌細(xì)胞的連接結(jié)構(gòu)，使心肌形成一個功能上的整體。鈣－連復(fù)合體作為心肌細(xì)胞閏盤中間連接的一個重要組成成分，是形成閏盤結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，已成為近年來的研究熱點。鈣－連復(fù)合體位于閏盤的黏合膜，同時也是肌原纖維的附著點，在心肌細(xì)胞的發(fā)育及成熟階段高度表達(dá)［4］。它同細(xì)胞骨架的相互聯(lián)系和相互作用有重要功能［4］:(1)介導(dǎo)心肌細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，使心肌細(xì)胞形成牢固連接;(2)固定心肌纖維的定向排列，防止心肌纖維滑脫，保持心肌纖維舒縮的一致性和協(xié)調(diào)性。因此，鈣－連復(fù)合是心肌細(xì)胞形態(tài)維持、物質(zhì)運輸和跨膜信息傳遞的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

鈣－連復(fù)合體功能的正常發(fā)揮有賴于其完整性，其組成成員質(zhì)和量的改變都可以引起復(fù)合體的功能異常。目前在成纖維細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ADAM10 可以特異性水解N－cadherin，產(chǎn)生N 端的NTF(95 kD)和C 端的CTF1(40 kD)，再由γ－分泌酶將CTF1 片段進(jìn)行水解，產(chǎn)生可溶性的CTF2(35 kD)?？缒さ腘－cadherin 依次被ADAMs 和γ－分泌酶水解，分子的完整性遭到破壞，影響了鈣－連復(fù)合體的形成［4－5］。鑒于以上成纖維細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中的研究結(jié)果，我們推測心肌細(xì)胞中N－cadherin 也存在這樣ADAMs 加工途徑，對N－cadherin 在細(xì)胞中的定位分布及鈣－連復(fù)合體的形成有重要作用

為了證明我們的推論，本實驗首先利用ADAM10 siRNA轉(zhuǎn)染入大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)，通過嘌呤霉素篩選，成功獲得了ADAM10 穩(wěn)定沉默的心肌細(xì)胞株。Western blotting 檢測結(jié)果顯示ADAM10 siRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組與陰性對照組相比，N－cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯提高，同時CTF 的表達(dá)也有所下調(diào)，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果也提示轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞跨膜表達(dá)的N－cadherin 增加。以上結(jié)果說明心肌細(xì)胞中ADAM10 對N－cadherin 的加工水解對N－cadherin 在細(xì)胞中的定位分布及鈣－連復(fù)合體的形成有重要作用。黏附實驗的結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞黏附能力明顯提高，從而進(jìn)一步明確了心肌細(xì)胞中ADAM10 對N－cadherin 的水解破壞了N－cadherin 分子的完整性，影響了鈣－連復(fù)合體的形成，并引發(fā)了相應(yīng)的病理生理改變。

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