孔 曼， 陳 娟， 周 潔， 朱文德， 萬麗敏， 熊宇芳， 李子希

1 華中科技大學同濟醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，武漢 430030

2 武漢市中心醫(yī)院檢驗科，武漢 430014

3 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，武漢 430070

研究表明，心肌細胞凋亡可參與多種心血管疾病的發(fā)生過程，如冠心病、心絞痛、心力衰竭、心肌炎及心臟自身免疫性疾病等［1］。Hamada等［2］研究發(fā)現(xiàn)大鼠腹主動脈狹窄所致的持續(xù)性壓力負荷升高可加重內質網(wǎng)未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），誘導內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）相關的細胞凋亡，最終導致擴張型心肌病和心力衰竭。在多種致心肌損傷因素的持續(xù)作用下，可引起過度ERS，通過CHOP（C／EBP homologous protein）、應激活化蛋白激酶和Caspase－12等內質網(wǎng)凋亡途徑相關信號分子引起細胞凋亡［3］?；谏鲜鲅芯?，我們擬通過觀察過氧化氫（H2O2）對體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞凋亡的誘導作用，探討其可能的信號通路是否與觸發(fā)ERS調控機制有關。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

細胞株為乳鼠心肌細胞（H9C2），來源于上海細胞典藏中心。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清由美國Gibco公司提供，伊紅和蘇木精、碘化丙啶溶液（PI）均購自Sigma 公司。實驗中所用抗體購自美國Santa Cruz公司。H2O2購自于北京宏盛苑化工有限公司，為分析純產(chǎn)品。Annexin Ⅴ－FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、活性Caspase－12 和活性Caspase－3檢測試劑盒購自凱基生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的H9C2細胞，迅速放入37℃水浴箱中直至融解；放入培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，12h 后換新鮮的培養(yǎng)液；每2～3天傳1代，1∶2的比例傳代。

1.2.2 細胞行蘇木精－伊紅染色 按照實驗分組鋪6孔板，待細胞密度為80%，吸棄上清液，加1 mL 95%乙醇固定40min，加蘇木精600μL染核15min，自來水洗后加0.1%鹽酸乙醇，分化10～30s，溫水返藍后再加伊紅10min，光鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 流式細胞術測細胞凋亡率 使用AnnexinⅤ－FITC細胞凋亡檢測試劑盒，按照使用說明通過檢測膜磷脂酰絲氨酸（PS）評估細胞凋亡。用不含EDTA 的0.25%胰酶液消化重懸細胞，2 000r／min離心5min，棄上清，PBS洗2次，收集（1～5）×105個細胞；加入500μL 的Binding Buffer懸浮細胞，隨后加入5μL AnnexinⅤ－FITC混勻，再加入5μL PI染液混勻，室溫避光反應5～15min，于1h內用流式細胞儀進行定量檢測。

1.2.4 流式細胞術檢測Caspase－12、Caspase－3 的活化 使用活性Caspase－12和活性Caspase－3檢測試劑盒，按照使用說明檢測活性Caspase－12和活性Caspase－3的熒光強度。用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，每管用0.5mL的BD Cytofix／Cytoperm（1×）溶液重懸細胞，冰置20 min后用0.5 mL 的BD Perm／wash buffer（1×）洗2 遍，加入100μL BD Perm／wash buffer（1×）＋20μL 活性Caspase－12和Caspase－3的抗體室溫避光放置30min，離心棄上清，再用1.0 mL BD Perm／wash buffer（1×）洗1 遍后，加入0.2 mL BD Perm／wash buffer（1×）重懸細胞，上機檢測。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 收集細胞提取蛋白，用BCA 法測得蛋白濃度。取樣品蛋白質100μg，SDS－PAGE電泳分離蛋白質，濕轉到NC 膜上，然后用5%的脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（稀釋度：兔抗p－PERK 和CHOP多克隆抗體1∶400；羊抗p－JNK 多克隆抗體1∶400；鼠抗β－actin單克隆抗體1∶10 000）室溫下?lián)u動孵育2h或4℃過夜，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗后顯影。掃描后定量分析。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 H2O2 誘導心肌細胞凋亡的作用

我們采用100μmol／L（低濃度）和500μmol／L（高濃度）的H2O2，對心肌細胞給予不同時間（0、4、8、12、24h）的刺激，用流式細胞儀檢測心肌細胞的凋亡率。結果顯示：100μmol／L H2O2可顯著誘導心肌細胞凋亡，細胞凋亡率明顯高于500μmol／L（P＜0.01），且細胞凋亡率在8h達到高峰，隨后細胞壞死率逐漸增加。500μmol／L H2O2處理組雖然有一定的細胞凋亡率，但壞死細胞比例顯著上調（圖1）。

2.2 H2O2 誘導心肌細胞凋亡的形態(tài)學變化

如圖2所示，正常組心肌細胞呈梭形，細胞與細胞間排列緊密；100μmol／L H2O2處理組的心肌細胞呈皺縮變形，500μmol／L H2O2處理組心肌細胞失去原有形態(tài)，質膜腫脹溶解壞死。

2.3 H2O2 對ERS標志蛋白表達的影響

如圖3所示，為進一步探討H2O2誘導心肌細胞凋亡的可能信號途徑，我們采用Western blot檢測ERS標志蛋白p－PERK 和CHOP 的表達水平。采用低濃度H2O2（100μmol／L）處理不同時間的心肌細胞作為實驗組，未處理組作為對照組，與藥物孵育后提取蛋白樣品進行Western blot分析。

圖1 流式細胞術檢測H2O2 對心肌細胞凋亡的影響Fig.1 Flow cytometry analyses of cell apoptosis induced by H2O2

圖2 不同濃度H2O2 刺激8h后心肌細胞的形態(tài)學變化（蘇木精－伊紅染色，×40）Fig.2 The morphological changes of myocardial cells induced by H2O2for 8h（HE staining，×40）

結果顯示：在上樣量一致的情況下，不同時間點H2O2處理組p－PERK 和CHOP 蛋白表達依次增高，至8h達到高峰，12h和24hCHOP蛋白的表達量與8h時間點相比則分別下調了48%和49%，12h和24hp－PERK 蛋白的表達量與8h時間點相比則分別下調了30%和40%。提示：H2O2誘導心肌細胞的凋亡與ERS有關，且在8h作用時間點達到高峰。

圖3 H2O2（100μmol／L）處理不同時間心肌細胞ERS標志蛋白的表達Fig.3 The expression of ERS marker proteins induced by H2O2（100μmol／L）in myocardial cells

2.4 化學伴侶PBA（4－phenylbutyric acid）對H2O2 誘導心肌細胞凋亡的影響

由于ERS的誘因之一是錯誤或未折疊蛋白在內質網(wǎng)內的聚集，而化學伴侶可以使錯誤或未折疊蛋白進行正確折疊，因此，化學伴侶PBA 是ERS抑制劑。我們將心肌細胞分為4組，即未處理組、PBA（500μmol／L）處理12h組、H2O2（100μmol／L）處理8h組、PBA（500μmol／L）預處理12h＋H2O2（100μmol／L）處理8h組。為進一步探討其機制，我們采用Western blot檢測與ERS相關的凋亡信號分子p－JNK 等的蛋白表達水平，采用流式細胞儀檢測心肌細胞內熒光標記的活化的Caspase－3 和Caspase－12。結果表明：PBA 預處理后可顯著逆轉H2O2誘導的p－JNK、p－PERK、CHOP的表達上調；使活化的Caspase－3和Caspase－12的含量顯著減少（P＜0.01），即ERS抑制劑PBA 可顯著逆轉H2O2誘導的心肌細胞凋亡（圖4、5）。

圖4 PBA 對H2O2 誘導的心肌細胞p－PERK、CHOP、p－JNK 蛋白表達的影響Fig.4 The effect of PBA on the expression of ERS marker proteins induced by H2O2in myocardial cells

圖5 PBA 對H2O2 誘導的心肌細胞Caspase－3和Caspase－12活化的影響Fig.5 The effect of PBA on the activation of Caspase－3 and Caspase－12induced by H2O2in myocardial cells

3 討論

大量研究表明氧化應激在心血管疾病的發(fā)病機制中有重要作用。近年來研究顯示：氧化應激與內皮功能障礙等病理生理機制相互作用，共同促進心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。Lennon等［4］首先發(fā)現(xiàn)低濃度的H2O2（10～100μmol／L）可誘導HL－60 細胞發(fā)生凋亡，而當H2O2濃度繼續(xù)升高時，便可導致大量的細胞壞死。此后，對氧化應激介導心肌細胞凋亡進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)H2O2或O－2等外源性活性氧均可誘導培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞凋亡，同時，由于細胞抗氧化防御系統(tǒng)受損而導致的內源性活性氧生成增加亦可介導心肌細胞凋亡［5］。這些研究結果均表明：氧化應激是心肌細胞凋亡的重要誘導因素。在本實驗中，我們的結果顯示高濃度的H2O2對細胞的作用是導致細胞壞死，而低濃度的H2O2導致細胞凋亡，與既往文獻報道一致。

ERS是由于某種原因導致細胞內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡、生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細胞器的病理過程［6］。研究表明：ERS反應是細胞的一種自我保護性機制，以恢復內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細胞生存，但是過強的或長時間的ERS 反應可以引起細胞凋亡［7］。越來越多的研究證實，ERS與心血管疾病的發(fā)生關系密切。

Zhao等［8］在小鼠缺血缺氧細胞模型中證實有活性氧的產(chǎn)生，內質網(wǎng)鈣泵對氧化損傷敏感，因此認為內質網(wǎng)可能是活性氧攻擊的重要目標之一。ERS的早期主要是內質網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94、CRT 表達上調和PERK－eIF2α磷酸化介導的蛋白合成暫停［9］。因此，心肌缺血早期和心肌肥大代償階段主要出現(xiàn)GRP78、CRT 表達和PERK、eIF2α磷酸化的上調，表明細胞通過ERS 調節(jié)自穩(wěn)態(tài)失衡，過強和持續(xù)的ERS可以通過內質網(wǎng)相關凋亡途徑引起細胞凋亡［9］。近年來PERK 在ERS中的作用受到關注，PERK 磷酸化激活后，早期可抑制蛋白合成，晚期則可上調CHOP的表達，活化ERS相關凋亡信號途徑。

高表達的CHOP通過上調促凋亡蛋白Bax、下調Bcl－2表達，促進線粒體細胞色素C 釋放、凋亡小體形成和Caspases活化從而導致細胞凋亡［10］。我們發(fā)現(xiàn)，低濃度H2O2誘導心肌細胞p－PERK 和CHOP表達顯著上調。推測：低濃度H2O2作用8h后引起心肌細胞過度ERS，通過CHOP、p－PERK等內質網(wǎng)相關凋亡途徑引起細胞凋亡。

Caspase－12存在于內質網(wǎng)膜上，ERS 可引起Caspase－12活化，另外IRE1 與腫瘤壞死因子受體相關因子2（tumor necrosis factor receptor－associated factor 2，TRAF2）結合啟動JNK 級聯(lián)反應，促進Caspase－12在內質網(wǎng)膜上聚集與活化，Caspase－12通過激活Caspase－9、Caspase－3 而誘導細胞凋亡［11－12］，其活化過程可不涉及細胞色素C 從線粒體釋放，表明Caspase－12通過不同于線粒體凋亡途徑的獨立信號轉導途徑介導細胞凋亡。

在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)H2O2誘導心肌細胞的p－JNK、p－PERK、CHOP 高表達，活化Caspase－3 和Caspase－12，加入ERS的抑制劑PBA 后，心肌細胞的凋亡率顯著下調，Western blot檢測結果顯示p－JNK、p－PERK、CHOP的表達也顯著降低。由此證實：氧化應激誘導心肌細胞凋亡與促發(fā)ERS有關。我們推論：ERS途徑可能是H2O2誘導心肌細胞凋亡的信號轉導通路之一。

綜上所述，我們的研究結果證實低濃度的H2O2可導致心肌細胞凋亡，高濃度的H2O2則導致細胞壞死，ERS的抑制劑PBA 可部分抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡，ERS介導的細胞凋亡途徑可能是H2O2誘導心肌細胞凋亡的信號轉導通路之一。

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