方 忠， 楊 琴， 熊 偉， 李光輝， 廖 暉， 李 鋒， 肖 駿

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院骨科，武漢 430030

骨缺損在臨床上十分常見，其治療一直是骨科領域的難題。隨著分子生物學理論及技術的發(fā)展與成熟，應用組織工程骨修復骨缺損已成為國內外學者廣泛認同的發(fā)展方向［1－2］。但組織工程骨的種子細胞與載體支架的選擇存在較大的爭議，我們前期研究證實了脂肪干細胞（adipose－derived stem cell，ADSCs）因其具有來源廣泛、易分離培養(yǎng)、分化能力強等優(yōu)點而被認為是組織工程的最佳種子細胞［3］。本研究進一步探討ADSCs 與殼聚糖／磷酸三鈣（CTCP）復合物支架在體外復合培養(yǎng)的相容性以及其構建組織工程骨的可行性，為構建組織工程骨提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

成年新西蘭大白兔，4月齡，體重3.0kg，雌性，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗學部。速眠新（長春市軍需大學獸醫(yī)研究所），Ⅰ型膠原酶、地塞米松、藻酸鈉、維生素C（Sigma公司）；胰酶、胎牛血清、DMEM－LG、DMFM／F12（Gibco公司），熒光標記小鼠抗兔抗體（CD29－FITC、CD31－FITC、CD34－FITC、CD44－PE、CD45－FITC、CD90－FITC、mouse lgG1－PE和mouse lgG2a－F1TC，BD 公司）。T 載體（Promega 公司），Trizol 試劑、脂質體 Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；Advantage polymerase mix、PCR 試劑盒（Clontech公司）；RT 試劑盒（Fermentas公司）；PCR 純化試劑盒（Roche公司）；限制性內切酶、T4噬菌體DNA 連接酶（TaKa－Ra公司）；鼠抗人Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、骨鈣素（BPG）多克隆抗體（Santa Cruz 公司）。質粒pAd－h(huán)BMP2由美國哈佛醫(yī)學院分子骨科中心Oliver博士惠贈；攜帶β－半乳糖酐酶基因的腺病毒對照載體（Adβgal）由我院婦產科劉英博士惠贈；大腸埃希菌DH5α以及293細胞為本實驗室保存。材料殼聚糖（分子量5.0×105，脫乙酰度91.8%）；磷酸三鈣（美國Sigma公司）。倒置相差顯微鏡（Nikon公司），掃描電鏡（S－520，HITACHI）。

1.2 ADSCs分離、培養(yǎng)與Ad－h(huán)BMP2重組腺病毒的制備和轉染ADSCs

ADSCs的分離、培養(yǎng)方法參見文獻［3］。AdhBMP2重組腺病毒的制備和轉染ADSCs參見文獻［4］。

1.3 多孔CTCP復合支架的制備

采用二次冷凍干燥法，準確稱量5g殼聚糖溶于100mL 1%的冰醋酸，待殼聚糖完全溶解后，再加入1.35g磷酸三鈣攪拌30 min使其充分溶解。將終溶液分裝于聚四氟乙烯培養(yǎng)皿，－20℃預冷成型，再放入－80℃冰箱過夜，然后置于－56℃冷凍干燥機中持續(xù)干燥48h。靜置12h 恢復常溫、常壓后，將材料取出，浸入5%三聚磷酸鈉交聯90 min，期間要不斷翻動，以使鈣沉積均勻。交聯后的材料再次置－56℃冷凍干燥機中二次冷凍干燥8h。將材料切割成5mm×5mm×1mm 大小，塑料袋密封包裝，60Goγ射線照射消毒（2.5kGy，5h），儲存于無菌培養(yǎng)瓶中備用。

二次冷凍干燥后的材料質地硬、脆，可被切削成任意形狀和大小，將材料浸泡入DMEM 培養(yǎng)液后稍變軟，并具有輕微的延展性，采用乙醇替代法測定材料的空隙率。將一定量的復合材料置于一定體積（V1）的乙醇中，循環(huán)抽真空脫氣泡后，材料和乙醇總體積記為V2，將材料移出，剩余乙醇體積記為V3，則材料孔隙率：P＝（V1－V2）／（V2－V3）。我們初步算得材料的孔隙率約為83%。利用掃描電鏡進一步測其空隙大小。

1.4 轉染Ad－h(huán)BMP2的ADSCs接種于CTCP復合支架

取支架材料用PBS 沖洗3 次，再用含雙抗的DMEM 培養(yǎng)液浸泡過夜，選擇第3 代轉染AdhBMP2的ADSCs消化離心，調整細胞密度為1×106／mL，滴入經DMEM 預濕的CTCP支架，置于6孔板中，每孔加入約0.5 mL 細胞，5%CO2恒溫37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h 后補加含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液2mL，并常規(guī)換液。次日換液，加入骨誘導培養(yǎng)液。

1.5 觀察指標

1.5.1 細胞形態(tài)學觀察 每日于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長及與材料粘附情況。細胞接種CTCP支架培養(yǎng)1 周后，取細胞支架復合物于0.25%戊二醛中固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，表面噴金后掃描電鏡下觀察。

1.5.2 RT－PCR 法檢測Collagen Ⅰ、BGP 的mRNA 表達 在培養(yǎng)第7天及第14天以溶解緩沖液溶解支架載體，離心收集脂肪細胞。以Trizol試劑裂解細胞。抽提細胞總RNA，測定RNA 濃度，用RT 試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。然后以cDNA 的第一鏈作為模板進行PCR 擴增。BGP 上游引物：5′－AGCTCAACCCCAATTGTGAC－3′，下游引物：5′－AGCTGTGCCGTCCATACTTT－3′；CollagenⅠ上游引物：5′－TTCAGCTATGGAGATGACAATC－3′，下游引物：5′－AGAGTCCTAGAGTGACTGAG－3′。PCR 條件為：94℃預變性5 min，隨后94℃變性45s，52℃退火45s，72℃延伸45s，共進行30個循環(huán)，再72℃延伸10min。PCR產物電泳，顯色條帶用圖像分析系統(tǒng)檢測（Alpha Imager 2000）。

1.5.3 Western blot測定Collagen Ⅰ、BGP 蛋白表達 在培養(yǎng)第7天及第14天，以溶解緩沖液溶解CTCP支架料，離心收集細胞。PBS 漂洗ADSCs，加入三去污劑裂解緩沖液收集細胞裂解物，室溫下12 000r／min離心10min，收集上清液。以每泳道15μL 加入SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳槽進行電泳；轉移至醋酸纖維膜；室溫下脫脂奶粉封閉2h，然后加入封閉液和一抗CollagenⅠ（1∶200）多克隆抗體，于搖床上4℃2h，PBS洗滌3次；室溫下Tris·HCl溶液孵育10min后，加入封閉液、二抗共同孵育1 h；將濾膜轉移到Tris·HCl中溫育10min；辣根過氧化物酶顯色，拍照。實驗重復3次，以β－actin為內參。

2 結果

2.1 ADSCs轉染Ad－h(huán)BMP2后形態(tài)學變化

Ad－h(huán)BMP2轉染后ADSCs形態(tài)規(guī)則，生長旺盛，隨培養(yǎng)時間延長多角型細胞增多。在熒光顯微鏡下可見增強型綠色熒光蛋白（EGFP）于轉染24h開始有表達，并證實在本實驗條件下，病毒轉染效率接近70%（圖1）。

圖1 ADSCs轉染Ad－h(huán)BMP2后倒置相差顯微鏡下形態(tài)及EGFP熒光顯影（×400）Fig.1 The morphology of the ADSCs transfected with Ad－h(huán)BMP2

2.2 支架材料及與細胞復合后觀察

通過掃描電鏡觀測我們所研制的生物材料CTCP，其孔徑大小為100～300μm，孔隙率83%（圖2），符合組織工程支架材料的基本要求。

倒置相差顯微鏡下觀察，ADSCs接種到CTCP支架材料上1d，可見材料不透明，無法觀察內部細胞生長粘附情況，但見細胞在支架材料邊緣粘附，表明細胞已在支架網孔表面貼壁并呈成纖維細胞樣生長；復合培養(yǎng)后3d，細胞向材料內表面生長。ADSCs在誘導或基因轉染條件下與CTCP支架纖維均展現了十分良好的生物相容性。電鏡觀察見復合培養(yǎng)3d后，ADSCs沿材料表面爬行生長。細胞接種支架培養(yǎng)7d后，細胞粘附在支架材料表面，孔洞內也有細胞生長，細胞之間通過突起相互連接，融合成片并分泌細胞外基質（圖3）。

圖2 光鏡（A）、電鏡（B）顯示殼聚糖／磷酸三鈣（CTCP）復合物支架孔徑大且孔隙率高Fig.2 Ultrastructures of the CTCP scaffold under the light microscopy（A）and electron microscopy（B）

2.3 ADSCs支架載體中特異性骨細胞外基質的CollagenⅠ、BGP表達

RT－PCR、Western blot檢測CollagenⅠ、BGP 表達結果顯示：共培養(yǎng)7d與14d時細胞載體中的CollagenⅠ、BGP均有表達，且呈增多趨勢（圖4、圖5）。

3 討論

骨的缺損修復和重建一直是臨床骨科所面對的難題之一［5－6］，且目前臨床上常用的骨移植和人工材料修復方法容易出現許多并發(fā)癥而使應用受到限制［7－8］。隨著上世紀末骨組織工程概念的提出，應用組織工程技術修復骨缺損成為骨科及口腔頜面整形外科的研究熱點。組織工程是隨著細胞生物學、分子生物學、基因技術、材料科學等高新技術迅速發(fā)展而出現的新興科學，被認為是一場意義深遠的醫(yī)學革命［9－10］。種子細胞、支架材料和可溶性生物活性因子是組織工程學研究的三個要素。其中理想的支架材料需具備以下幾個特征：具有高度的生物相容性、可生物降解性和可生物吸收性；同時為了有利于細胞粘附、生長、繁殖、分化，以及移入人體后能執(zhí)行正常的生理功能，支架應該具有負載骨誘導因子和活性因子的合適表面；支架的內部結構應該是多孔的，并且孔間是相連的網絡結構；支架要有必要的力學性能。

圖3 復合培養(yǎng)7d時電鏡下ADSCs生長狀態(tài)（×700）Fig.3 The growth of ADSCs after co－culture for 7days under the electron microscopy（×700）

圖4 共培養(yǎng)7d與14d 時細胞支架載體中CollagenⅠ蛋白和BGP表達的RT－PCR結果Fig.4 The CollagenⅠprotein and BGP expression in the scaffold after co－culture for 7or 14days detected by using RT－PCR

圖5 共培養(yǎng)7d與14d 時細胞支架載體中CollagenⅠ蛋白和BGP表達的Western blot結果Fig.5 The CollagenⅠprotein and BGP expression in the scaffold after co－culture for 7days or 14days detected by Western blot

新型生物材料殼聚糖－磷酸三鈣（CTCP）支架中的殼聚糖是甲殼類動物的外殼主要成分甲殼素的合成物，是具有生物更新性、生物降解性、生物相容性、無免疫原性、無細胞毒性，還具有生物功能性的天然材料，其化學成分為N－脫乙酰基化合物，屬堿性氨基多糖類物質，是一種少見的帶正電荷的生物降解性聚合物，在體內酶的作用之下，水解成多聚糖，終產物葡糖胺被機體吸收。其降解產物在早期能刺激膜內成骨和軟骨形成，加速愈合過程［11］。殼聚糖還能夠刺激和誘導結締組織和骨再生，促進具有成骨潛能細胞的分化并有利于骨形成［12］。

單純殼聚糖材料機械性能差，降解速度快，并且其降解產物還會使局部pH 值降低，引起炎癥反應。磷酸三鈣是一種生物降解性陶瓷材料，化學結構由鈣磷構成，與骨基質中的無機鹽成分相似，具有良好的生物相容性和骨引導活性，機械性能好［13］，但其降解速度慢且降解產物呈堿性［14］。殼聚糖與磷酸三鈣復合材料能互相中和，且復合材料的強度、韌性、降解速度都比單一材料有較大提高，早已有學者將這一復合材料應用于骨組織工程［15－16］。掃描電鏡下可見利用冷凍干燥法制備的CTCP 支架具有多孔網狀結構，材料的孔隙率約83%，孔隙大小100～300μm，且互相通連，材料質地硬、脆，可被切削成任意形狀及大小，將材料浸泡入DMEM 培養(yǎng)液后稍變軟，并具有輕微的延展性，符合生物材料的基本要求。

本研究利用CTCP 作為轉基因ADSCs的載體，就是利用了其生物學特性，為新骨的生長和沉積提供支架和基質，發(fā)揮骨傳導作用。細胞在CTCP內均勻分布，CTCP 內的大量孔隙為細胞所需營養(yǎng)的滲透提供了基礎。由于良好的生物相容性，細胞容易附著，不易被液體沖走，便于局部增殖和分泌，發(fā)揮成骨作用。由于BMP－2具有很強的骨誘導作用，所以基因轉染的ADSCs既作為成骨的種子細胞，又發(fā)揮了誘導作用［17］。雖然有報道認為殼聚糖材料可引起無菌性炎癥，但在本實驗中僅觀察到有少量的炎癥細胞，對骨組織的生成沒有明顯的影響。

我們還發(fā)現，當ADSCs與CTCP粘附后，具有向成骨細胞分化的趨勢，分泌、表達的骨鈣素明顯增多，這種作用是與攜帶的目的基因有關，還是與CTCP的復合材料有關，還有待進一步證實。

總之，新型復合天然生物材料CTCP具有理想的三維多孔結構和良好的生物相容性及骨誘導作用，其與轉染Ad－h(huán)BMP2的ADSCs有良好的細胞相容性，可作為骨組織工程理想的支架材料。

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