基于接枝二茂鐵介體的BOD 微生物傳感器

胡 磊,李 軼

(1.河海大學(xué)淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京 210098;2.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 江蘇南京 210098)

生化需氧量(BOD)作為重要的衡量水與廢水中有機(jī)污染程度的指標(biāo),在水污染控制中具有非常重要的作用。傳統(tǒng)經(jīng)典的BOD 測量方法需要5 d 時間,而且操作復(fù)雜、受外界影響大,不能滿足對污染水體或污染源在線監(jiān)測的要求[1]。自Karube 等[2]于1977 年最先研制出用于測量BOD 的微生物傳感器后,國內(nèi)外很多學(xué)者研發(fā)出各種基于不同菌種及混合菌種的BOD 傳感器[3-6]?，F(xiàn)有的基于微生物傳感器的快速測定方法將測量時間從5 d 縮短到30 min,極大地滿足了對水和廢水BOD 監(jiān)測的要求,但是也存在著對水樣中DO 依賴大等問題。

近年來,越來越多的學(xué)者[7-9]研究利用氧化還原介體代替分子氧作為監(jiān)測微生物分解代謝的最終電子受體。在微生物的生化反應(yīng)中氧化態(tài)的介體失去電子,轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)的介體,此過程的電子變化產(chǎn)生傳感器電流響應(yīng),從而可以定量反應(yīng)中氧化還原物質(zhì)的量。很多利用介體促進(jìn)微生物生化反應(yīng)的研究,反應(yīng)體系是水溶液,且介體的濃度很高,如達(dá)40 mmol/L[10]和55 mmol/L[11],導(dǎo)致介體的浪費(fèi)。筆者針對以上問題,開發(fā)出基于接枝二茂鐵介體的微生物傳感器,將介體接枝到大分子材料中,并包埋于聚乙烯醇(PVA)中,保持了介體的性能并避免了介體的流失,很好地應(yīng)用于測量廢水中的BOD。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

二茂鐵(Fc),KH550 (3-aminopropyltriethoxysilane,3-APTES), 聚乙烯醇(PVA, 醇解度90%, 分子量22 000)購自南京曙光化學(xué)有限公司,其余試劑均采用分析純試劑。磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH =7.2)(由36 mL 的71.64 g Na2HPO412H2O 和14 mL 的31.21 g NaH2PO42H2O 混合配制而成)。BOD 標(biāo)準(zhǔn)校正溶液(GGA)[12],采用葡萄糖(150 mg/L)、谷氨酸(150 mg/L)混合溶液。

1.2 二茂鐵介體的接枝

將Fc與微生物固定化于PVA 包埋材料中,在微生物對有機(jī)物的降解反應(yīng)中代替氧為最終的電子受體。由于Fc 是小分子有機(jī)物,其分子的大小(nm 級)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于包埋材料的孔徑(平均為μm 級),故需要與大分子有機(jī)物進(jìn)行接枝。SBA-15 是一種具有巨大比表面積的介孔氧化硅材料,其豐富的表面羥基為接枝創(chuàng)造了良好的條件,其制備過程見文獻(xiàn)[13] ,二茂鐵甲酸的制備見文獻(xiàn)[14] 。將6.9 g 二茂鐵甲酸和6.63g KH550 溶解在50mL 氯仿和50mL N,N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中,加入4.67 g 1-羥基苯并三唑,當(dāng)上述溶液冷卻到0 ℃時,加入6.68 g EDCI(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)-propyl] carbodiimide hydrochloride)和3.6 g NMM(N-methylmorpholine)。將溶液從冰浴中取出,常溫攪拌24 h,加入8 g SBA-15并繼續(xù)攪拌48 h。過濾所得的混懸液,濾渣在索氏提取器中用氯仿過夜洗滌除去游離的成分,所得的固體真空干燥, 得到14.2 g 樣品, 樣品被標(biāo)記為Fc-SBA-15。Fc-SBA-15 的合成步驟見圖1。

1.3 微生物培養(yǎng)及固定化

圖1 Fc-SBA-15 合成示意圖

微生物選用從活性污泥(取自江心洲污水處理廠)分離出的混合菌種。將取來的活性污泥經(jīng)雙層紗布過濾后,在濾液(混合菌種)中投加好氧菌培養(yǎng)基,包含0.1%蛋白胨,0.1%牛肉膏及0.1%CaCl2。在30 ℃水浴中曝氣培養(yǎng)24 h,菌液在550 nm 波長處的吸光度達(dá)到0.8 時,將菌液以7 200 r/min 離心5 min,離心后用pH 為7.2 的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,清洗后的菌液再次離心。重復(fù)此過程兩遍后,將離心后的菌泥與Fc-SBA-15 介體懸濁液、10%的PVA 溶膠進(jìn)行混合包埋,混合均勻后壓制成片(厚度為0.3μm),室溫晾干后裁剪成適合的大小,作為傳感器的生物敏感材料。

1.4 傳感器系統(tǒng)的構(gòu)建

利用三電極系統(tǒng)作為電化學(xué)的換能器。分別用玻碳電極(截面直徑6mm)為工作電極,Pt 電極為對電極,飽和甘汞電極為參比電極,以通路的電流值為測量指標(biāo)。玻碳電極在使用前分別用1.0 μm、0.3μm和0.05 μm α-Al2O3打磨至光滑,每次打磨后均用去離子水仔細(xì)清洗。最后打磨好的玻碳電極在室溫下晾干。和以前相關(guān)的研究[15]相比,本研究使用了更少的Fc 介體,并有效地阻止介體從包埋材料中流失。

2 結(jié)果和討論

2.1 接枝Fc 樣品的表征

分析Fc-SBA-15 和SBA-15 樣品的紅外光譜(圖2),SBA-15 在3 750 cm-1處有清晰的振動譜帶,此振動吸收為硅羥基吸收峰,Fc-SBA-15 在波數(shù)3 750 cm-1處此振動譜帶明顯退化,顯示硅羥基被反應(yīng)消耗。Fc-SBA-15在波數(shù)3 100 ～2 800 cm-1和1 550 ～1 250 cm-1處有明顯的振動,此振動帶歸屬于N—H和C—H 鍵[11],因?yàn)榧僑BA-15 在此區(qū)域沒有振動,而KH550 中含有N—H 和C—H 鍵,說明KH550 的骨架存在于Fc-SBA-15 中。另外,1 700 ～1 500 cm-1處的振動歸屬于酰胺基團(tuán),酰胺基團(tuán)是KH550 的氨基與二茂鐵甲酸的羧基縮合的結(jié)果,由此證明了Fc已被成功接枝到了SBA-15 上。

圖2 Fc-SBA-15 和SBA-15 的紅外譜圖

由圖3 可知,電極插入于0.01M 的PBS 溶液中,電位的掃描速度為50 mV/s,固定了Fc-SBA-15 的介體具有明顯的氧化還原峰,而對照樣SBA-15 則沒有氧化還原峰,證明了在電化學(xué)反應(yīng)中起電子傳遞作用的物質(zhì)是Fc。

圖3 介體的循環(huán)伏安

2.2 傳感器的性能

在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下,用BOD5為50 m/L 的GGA標(biāo)準(zhǔn)溶液對傳感器進(jìn)行測試。結(jié)果表明,傳感器的質(zhì)量濃度線性范圍為2 ～300 mg/L,單個傳感器連續(xù)測量20 個標(biāo)準(zhǔn)樣品的精密度為4.2%,傳感器能連續(xù)穩(wěn)定工作35 d(傳感器響應(yīng)電流衰減在15%以下)。

2.3 pH、溫度和重金屬離子的影響

溶液中的pH 值影響著微生物的生理狀態(tài)?？疾煸谝欢ǖ臓I養(yǎng)條件(ρ(BOD5)=100 mg/L,pH 為6～9)下傳感器固定化微生物的活性。實(shí)驗(yàn)表明,傳感器響應(yīng)電流差ΔΙ隨著pH 值的增加而逐漸增大,響應(yīng)電流差ΔΙ在pH 值為7.2 時最大,然后逐漸下降。因此pH 值為7.2 時是最佳條件,具體見圖4。

圖4 pH 對傳感器的影響

溫度是影響微生物生理代謝的重要因素,適宜的溫度能提高微生物的生理活性。在ρ(BOD5)=100mg/L,溫度為20 ～40 ℃的營養(yǎng)條件下,考察了傳感器的響應(yīng)電流差。結(jié)果表明,隨著溫度的上升,傳感器的響應(yīng)電流差逐漸增大,溫度達(dá)到30 ℃時響應(yīng)值最高,隨后響應(yīng)值緩慢下降。結(jié)果表明溫度為30 ℃時為系統(tǒng)微生物的最適宜溫度,詳見圖5。

圖5 溫度對傳感器的影響

生活污水和工業(yè)廢水中會含有多種重金屬。常見的重金屬離子有Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+等。適量的重金屬對微生物的生理影響不大,過量的重金屬對微生物會產(chǎn)生抑制作用,降低微生物的生理活性,使微生物從分解代謝為主轉(zhuǎn)為內(nèi)源代謝為主,從而降低了傳感器的響應(yīng)電流值。筆者研究了Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+這5 種重金屬離子對傳感器的影響。結(jié)果表明, 在重金屬濃度低于100 mmol/L 時,重金屬對傳感器響應(yīng)無影響(抑制率小于5%)。重金屬濃度大于500 mmol/L 時,對傳感器的微生物有明顯的抑制作用(抑制率大于15%)。5種重金屬離子的抑制率由大到小順序?yàn)椋篜b2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Zn2+。

2.4 實(shí)際廢水監(jiān)測

對污染河道河水,污水處理廠(江心洲污水處理廠)進(jìn)水、出水及食品工業(yè)廢水分別進(jìn)行BOD 傳感器快速測量,并與BOD5相對照(表1)。結(jié)果均表明Fc傳感器法測得的BOD 值(BODs)與標(biāo)準(zhǔn)的五日法測定的值具有良好的可比性。相比而言,低濃度的河水水樣和污水處理廠出水的相關(guān)度略差?？赡苁且?yàn)楹铀臀鬯幚韽S出水中難生物降解的大分子有機(jī)物相對較多,微生物短時間難以降解。

表1 實(shí)際廢水監(jiān)測結(jié)果

3 結(jié) 論

a.與大分子材料SBA-15 接枝處理而得的介體Fc-SBA-15,在保持了電化學(xué)活性的同時,也阻止了介體從包埋材料中流失。

b.實(shí)驗(yàn)得出傳感器的最優(yōu)化工作條件為pH 7.2,溫度30 ℃。廢水中常見的Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+重金屬離子在100 mmol/L 濃度下對傳感器無影響。

c.傳感器的線性范圍為2 ～300mg/L,連續(xù)測量20 個樣品的精密度為4.2%,能連續(xù)工作35 d,在線性范圍內(nèi)對低、中、高濃度實(shí)際廢水測得的BOD 值,與BOD5均具有較好的相關(guān)度。

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