徐曉薇，王麗芳，錢仁卷，楊燕萍

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

蘭科植物的自然變異較為豐富，長期以來人們從采挖的大量植株中發(fā)現(xiàn)奇異單株，但這種從野生變異中選擇品種的做法造成了蘭花盲目、掠奪性的采挖，造成珍貴種質(zhì)資源的外流。由于野生資源整體上趨于減少，自然變異產(chǎn)生的新品種數(shù)量也會(huì)變得越來越少。采用人工技術(shù)改良或創(chuàng)造新種質(zhì)成了重要的方法之一，其中誘變技術(shù)是改良品種快速便捷的手段。本文以春蘭的F1根狀莖為材料，研究秋水仙素處理對(duì)春蘭根狀莖生長、分化和誘變效應(yīng)，為春蘭多倍體誘變育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以春蘭F1根狀莖繼代繁殖幾代后穩(wěn)定生長的根狀莖為材料。

1.2 方法

1.2.1 根狀莖的浸泡處理

將生長較為一致的1 cm左右根狀莖浸入到含不同濃度秋水仙素 (0，0.10%，0.20%)的溶液中，分別進(jìn)行不同時(shí)間處理。A1-A4用0.05%秋水仙素分別處理 1，2，3，4 min;B1-B4用0.10%秋水仙素分別處理1，2，3，4 min;C1-C4用0.20%秋水仙素分別處理1，2，3，4 min;以清水為對(duì)照 (CK)。每處理6瓶，每瓶10個(gè)根狀莖。處理?xiàng)l件為25℃，搖床轉(zhuǎn)速90 r·min-1。

1.2.2 處理材料的培養(yǎng)和觀察

將處理后的根狀莖接到分化培養(yǎng)基 (1/2MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1)上，(26±1)℃下每天光照12 h。培養(yǎng)過程中觀察根狀莖的生長情況，記錄根狀莖受害率、分化率和生長狀態(tài)等。受害率/%=受傷害的個(gè)體數(shù)/存活外植體數(shù)。分化率/%=分化出苗的個(gè)體數(shù)/存活外植體數(shù)。

誘導(dǎo)率/%=嵌和體+四倍體/取材數(shù)。

加倍率/%=四倍體/取材數(shù)。

將分化苗接到生根培養(yǎng)基 (1/2MS+NAA 2.0 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1)上。

1.2.3 細(xì)胞學(xué)染色體的觀察

取分化出苗的分裂增生能力強(qiáng)的原球莖或根尖，應(yīng)用植物有絲分裂染色體壓片技術(shù)制備標(biāo)本。操作步驟如下:取根尖用飽和α-溴萘溶液4℃前處理24 h，固定液 (甲醇∶冰醋酸為3∶1)固定2 ～24 h，1 N HCl常溫下解離5 min，60℃水浴解離3 min，染色，壓片，鏡檢，拍照。對(duì)30個(gè)以上染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行染色體觀察和計(jì)數(shù)，取其平均值作為該植株體細(xì)胞染色體的數(shù)目，用這種方法分別確定出二倍體植株和四倍體植株體細(xì)胞的染色體的個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理對(duì)原球莖生長和分化的影響

將秋水仙素處理過的原球莖在培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d后，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)其受害率和分化率 (圖1)。

從圖1可見，B4，C1，C4受害率明顯高與對(duì)照，均達(dá)到了20%，其分化率在52.0% ～57.5%，也顯著低于對(duì)照 (92.0%)。在相同浸泡時(shí)間處理時(shí)，秋水仙素濃度越高，其分化率越低。而采用相同濃度處理時(shí)，原球莖基本上隨著浸泡時(shí)間的增加其分化率在逐步下降。這說明秋水仙素對(duì)原球莖生長和分化有抑制作用。

圖1 秋水仙素處理對(duì)原球莖生長和分化的影響

2.2 秋水仙素處理的誘變效應(yīng)

將處理后的原球莖接種到繼代培養(yǎng)基上，部分原球莖增殖分化，新形成的部分明顯比對(duì)照大，其分化出的植株粗壯，莖部明顯變粗，這些植株可能是多倍體 (圖2)。

圖2 秋水仙素處理后再生植株表型及染色體變異

在處理后原球莖分化的植株中，還發(fā)現(xiàn)多葉、葉片變寬變厚、顏色加深、呈墨綠色、矮化等類型統(tǒng)計(jì)變異植株占取材植株的百分率 (表1)。

與對(duì)照相比，秋水仙素濃度處理除 A1外，其余的再生植株部分發(fā)生變異，不同濃度處理產(chǎn)生的植株變異百分率大小依次為 B3＞B2＞C2＞A3＞B1＞A4＞ B4＞A2＞C4＞C3＞C1，即秋水仙素濃度為0.10%，誘導(dǎo)率相對(duì)其他濃度要高;相同濃度不同時(shí)間處理時(shí)，當(dāng)濃度為0.10%時(shí)，處理3 d的變異率最大為19%，且再生植株四倍體加倍率為處理3 d時(shí)間最高，達(dá)4% ～5%。崔廣榮等［4］認(rèn)為在相同時(shí)間的條件下，秋水仙素濃度越高，多倍體的誘變頻率越高;反之亦然，在相同秋水仙素濃度處理?xiàng)l件下，處理時(shí)間越長，多倍體誘變頻率也越高。

表1 秋水仙素處理后再生植株變異率

3 小結(jié)和討論

以蘭花原球莖和根狀莖為材料進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)在國內(nèi)外已有一些研究報(bào)道。但不同研究者由于采用的材料不同，處理方法不同，所得到的研究結(jié)果也不盡相同。Dolezel等［2］用秋水仙素對(duì)蘭屬雜種的原球莖進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度、處理時(shí)間和多倍體誘導(dǎo)率之間不是簡單的相關(guān)關(guān)系，用1 mg·mL-1秋水仙素處理7 d獲得的四倍體最多;Hsien 等［2］用 125 mg·L-1秋水仙素處理 Dortis pulcherrima的原球莖，當(dāng)原球莖直徑為1.0～1.2 mm時(shí)，原球莖再生率為42% ～59%，再生植株中46%為四倍體;Kim等［4］用0.01%和0.05%秋水仙素處理寒蘭根狀莖，處理1周根狀莖的存活率分別為82.3%和57.2%，在再生植株中0.01%處理2周、0.05%和0.10%處理1周的多倍體

(2n=66～80)誘導(dǎo)率分別為4.5%，5.2%，6.7%;李雪嬌等［5］以野生碧玉蘭試管苗為材料，0.04%的秋水仙素處理72 h效果最好，誘導(dǎo)變異率達(dá)60%，死亡率為30%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)秋水仙素處理的春蘭根狀莖分化率明顯低于對(duì)照，再生植株的變異誘導(dǎo)率與秋水仙素濃度和處理時(shí)間無明顯的簡單相關(guān)關(guān)系，變異試管苗形態(tài)上表現(xiàn)為葉片變寬、葉色加深、葉面粗糙、植株矮壯，且生長緩慢。當(dāng)秋水仙素濃度為0.10%、處理3 d時(shí)，誘導(dǎo)率最高為19%，同時(shí)四倍體加倍率處理3 d最大，但與秋水仙素的濃度處理差異不大，原因有待于進(jìn)一步研究。

［1］ 崔廣榮，張子學(xué)，張從宇，等.文心蘭多倍體誘導(dǎo)及其鑒定 ［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010(1):184-190.

［2］ Dozel J， Novak F J， CihalikovaJ， etal. Induction of tetraploid cymbidium plants from colchicines-treated protocorms Cultured in vitro ［J］. Plant Tissue Cell Culture，1984，455-456.

［3］ Hsien R M，Chen W H，Wu C C，et al.Artificial Induction of polyploidy in Doritis Pulcherrima［J］.Report of the Taiwan Sugar Research Institute，1991，132:13-18.

［4］ Kim Miseon， WonJeYang， SongChangHoon， etal.Polyploidy induction of Cymbidium Kanran by treatment of colchicine in vitro ［J］.Journal of Horticulture Science，1997，39(1):73-76.

［5］ 李雪嬌，李枝林，黃麗萍.野生碧玉蘭多倍體誘導(dǎo)及鑒定［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(13):261-266.