陳 芳， 覃順旺， 王躍華， 陳 燕， 楊蕓燕， 廖海松

(成都大學(xué)， 四川 成都 610106)

杜鵑蘭(Cremastraappendiculata(D.Don) Makino)是蘭科中多年生藥用草本植物[1]，用干燥假鱗莖入藥，夏、秋兩季采挖[2]。杜鵑蘭是生藥山慈菇的主流品種，山慈菇是中藥里常用的一味，其味甘，性涼，根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的化學(xué)成分主要有黃酮類[3]、生物堿類、菲類、聯(lián)芐類等80余種化合物[4]，具有清熱解毒，化痰散結(jié)的功效[5]?，F(xiàn)代臨床上配伍應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌、降壓、抗痛風(fēng)[6]、致突變性、抗血管生成活性、毒覃堿M 3受體阻斷作用[7]，國(guó)外的一些學(xué)者們通過(guò)活性篩選從杜鵑蘭植株中分離得到四個(gè)化合物，其中的一個(gè)化合物具有較強(qiáng)的抗血管生成的活性[8]，在市場(chǎng)上具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。鑒于杜鵑蘭巨大的藥用價(jià)值，市場(chǎng)需求量大，需要快速獲得杜鵑蘭類原球，為種苗繁殖提供材料。原球莖在繼代過(guò)程中能不斷分裂增殖產(chǎn)生新的類原球莖，增殖時(shí)在原球莖表面或內(nèi)部的薄壁組織中的一些核大、質(zhì)濃的胚性細(xì)胞分裂后形成胚性細(xì)胞團(tuán)，胚性細(xì)胞團(tuán)可繼續(xù)發(fā)育形成類原球莖[9]。類原球莖現(xiàn)已經(jīng)作為許多蘭科植物的植株再生、細(xì)胞工程以及遺傳轉(zhuǎn)化的主要材料或受體[10]，通過(guò)類原球莖增殖是杜鵑蘭屬植物快速繁殖的有效途徑。本研究利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)杜鵑蘭類原球莖快速增殖的影響因素進(jìn)行研究，建立較完整的增殖體系。

1 材 料

杜鵑蘭(Cremastraappendiculata(D.Don) Makino)種子經(jīng)過(guò)無(wú)菌萌發(fā)后形成的原球莖，放入B 5基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后形成類原球莖，作為外植體。

2 方 法

2.1 基本培養(yǎng)基

在無(wú)菌條件下，從培養(yǎng)瓶中選取生長(zhǎng)良好的白色或嫩綠色的杜鵑蘭類原球莖，用手術(shù)刀切割成適宜大小后，轉(zhuǎn)入不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2 MS、1/4 MS、B 5、N 6、KC)中進(jìn)行類原球莖增殖研究，在溫度為20 ℃、光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx、光照12 h·d-1的條件下培養(yǎng)，觀察類原球莖整個(gè)增殖過(guò)程，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)類原球莖增殖倍數(shù)。

2.2 類原球莖增殖條件優(yōu)化

選取萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，NAA)(A)、活性炭(B)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)(C)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)(D)作為四因素，分別設(shè)置3個(gè)濃度，見(jiàn)表1，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素對(duì)應(yīng)的濃度見(jiàn)表3，共9組試驗(yàn)，3個(gè)重復(fù)。在溫度為20 ℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，光照12 h·d-1的條件下培養(yǎng)，50 d后統(tǒng)計(jì)類原球莖增殖情況。

表1 L9(34)類原球莖增殖因素和水平表

2.3 類原球莖增殖生長(zhǎng)曲線

選取生長(zhǎng)良好的白色或嫩綠色類原球莖，切割為適宜大小后，轉(zhuǎn)接入B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1+土豆泥30.0 g·L-1的培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察并記錄類原球莖生長(zhǎng)情況，每隔5 d取出稱重一次，記錄每瓶類原球莖重量，確定杜鵑蘭類原球莖增殖培養(yǎng)的最佳周期。

2.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Office Excel 2010軟件與正交助手Ⅱ軟件完成。

類原球莖平均增殖倍數(shù)=(增殖后類原球莖重量-接種重量)/接種重量。

3 結(jié)果與分析

3.1 基本培養(yǎng)基對(duì)杜鵑蘭類原球莖增殖的影響

將生長(zhǎng)良好的白色或嫩綠色類原球莖轉(zhuǎn)接入不同基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50 d后，觀察并記錄類原球莖增殖情況，結(jié)果見(jiàn)表2。

在植物快繁研究中，基本培養(yǎng)基的篩選極其重要。從表2和圖1可知，杜鵑蘭類原球莖快速增殖的最佳基本培養(yǎng)基為S 4，即B 5培養(yǎng)基，培養(yǎng)45 d后，平均增殖倍數(shù)為2.12倍。觀察發(fā)現(xiàn)，類原球莖在S 1培養(yǎng)基中，增殖速度慢，褐化情況嚴(yán)重，正常生長(zhǎng)的類原球莖呈白色和嫩綠色；在S 2和S 3培養(yǎng)基中，增殖速度較S 1快，呈白色，新生類原球莖體積較小；在S 4培養(yǎng)基中，增殖速度最快，呈白色或嫩綠色，長(zhǎng)勢(shì)最佳；在S 5和S 6培養(yǎng)基中，褐化死亡和部分呈水漬狀，增殖速度較慢。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，S 1、S 2、S 3平均增殖倍數(shù)明顯低于S 4，分析發(fā)現(xiàn)，S 1培養(yǎng)基中含有較高的銨態(tài)氮與高水平的鹽溶液，但杜鵑蘭植物在S 1培養(yǎng)基中類原球莖增殖效果不佳，可降低銨態(tài)氮與鹽含量，使增殖速度加快，S 4培養(yǎng)基中僅含硝態(tài)氮，且無(wú)機(jī)鹽濃度較低，最適合杜鵑蘭植物類原球莖的增殖，與毛堂芬等[11]的研究結(jié)果一致。綜上，杜鵑蘭類原球莖增殖的最佳基本培養(yǎng)基為B 5培養(yǎng)基。

圖1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)杜鵑蘭植物類原球莖增殖的影響Fig.1 Effects of different basic media on proliferation of C. appendiculata protocorm-like bodies

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)杜鵑蘭植物類原球莖增殖的影響

3.2 杜鵑蘭植物類原球莖增殖條件優(yōu)化

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將生長(zhǎng)良好的杜鵑蘭植物類原球莖轉(zhuǎn)接入添加了NAA、活性炭、IBA和IAA的B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+土豆泥30.0 g·L-1的培養(yǎng)基中，接種前稱重，培養(yǎng)50 d后取出除去培養(yǎng)基后再次稱重，統(tǒng)計(jì)類原球莖增殖倍數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

由表3可知，未添加細(xì)胞生長(zhǎng)素和活性炭的Y 1培養(yǎng)基類原球莖增殖效果最差，培養(yǎng)過(guò)程中易褐化死亡，類原球莖長(zhǎng)勢(shì)差；在添加了細(xì)胞生長(zhǎng)素和活性炭的Y 2～Y 9培養(yǎng)基中，類原球莖增殖速率明顯高于Y 1培養(yǎng)基，其中Y 9培養(yǎng)基增殖速度最快，類原球莖為白色或嫩綠色，體積大，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)素和活性炭在杜鵑蘭植物類原球莖增殖過(guò)程中至關(guān)重要，這和吳彥秋等[12]對(duì)杜鵑蘭原球莖增殖研究中一致。通過(guò)極差分析可知，4個(gè)因素對(duì)杜鵑蘭植物類原球莖增殖的影響程度依次為A>B>D>C，即培養(yǎng)基中NAA影響最大，活性炭次之，然后是IAA，影響最小的是IBA。杜鵑蘭植物類原球莖增殖的最佳組合為A 3 B 3 C 2 D 3，即B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1+土豆泥30.0 g·L-1。

表3 類原球莖增殖直觀分析

由表4可知，四個(gè)因素僅因素A達(dá)到顯著水平，因素NAA檢驗(yàn)值F=31.74，F(xiàn)0.05=19.00，F(xiàn)0.01= 99.00，檢驗(yàn)值F0.05

表4 方差分析結(jié)果

圖3 接入培養(yǎng)基的類原球莖(a)和增殖培養(yǎng)45 d后的類原球莖(b) Fig.3 Comparison of protocorm-like bodies cultured in culture medium (a) and protocorm-like bodies cultured for 45 days after proliferation (b)

3.3 杜鵑蘭植物類原球莖增殖生長(zhǎng)曲線

將生長(zhǎng)良好的白色或嫩綠色類原球莖從培養(yǎng)瓶中取出，在無(wú)菌條件下切割，轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，定期稱重，記錄類原球莖生長(zhǎng)情況。結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 杜鵑蘭類原球莖增殖生長(zhǎng)曲線Fig.2 Procorm-like bodies proliferation and growth curve of C. appendiculata

從圖2可知，將生長(zhǎng)情況良好的杜鵑蘭植物類原球莖切割后轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)0～15 d處于延遲期，在此階段，由于植物細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境，是適應(yīng)新環(huán)境和促進(jìn)切割傷口愈合的時(shí)期，因而杜鵑蘭類原球莖重量變化極小；15～45 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在該時(shí)期，細(xì)胞迅速增大與分裂增殖，體積與數(shù)量快速增加，因而杜鵑蘭類原球莖重量快速增加；45～60 d處于穩(wěn)定期，該時(shí)期杜鵑蘭類原球莖總重量相對(duì)穩(wěn)定，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大量消耗后大幅度下降，產(chǎn)生的不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性物質(zhì)也增多，之后進(jìn)入衰亡期[13]。結(jié)果表明，杜鵑蘭類原球莖細(xì)胞增殖生長(zhǎng)曲線為“S”型，類原球莖增殖的最佳培養(yǎng)周期為45 d，杜鵑蘭植物類原球莖增殖倍數(shù)可達(dá)8.20倍。

通過(guò)觀察試驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭類原球莖在增殖培養(yǎng)7 d后，類原球莖上開(kāi)始長(zhǎng)出白色絨毛，之后，絨毛迅速生長(zhǎng)，培養(yǎng)15 d后開(kāi)始有新的白色類原球莖長(zhǎng)出，繼續(xù)培養(yǎng)，白色類原球莖體積增大，顏色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)槟劬G色，培養(yǎng)20 d后，白色類原球莖開(kāi)始大量長(zhǎng)出，直到培養(yǎng)45 d后，杜鵑蘭類原球莖增殖速度逐漸變緩。杜鵑蘭植物類原球莖增殖過(guò)程中增殖速度與培養(yǎng)初期生長(zhǎng)的白色絨毛有關(guān)，絨毛越豐富，增殖速度越快，可能與絨毛輔助進(jìn)行水分、氧氣與營(yíng)養(yǎng)成分的吸收有關(guān)。

4 結(jié)論與討論

杜鵑蘭植物通過(guò)類原球莖增殖快速繁育是規(guī)?；a(chǎn)杜鵑蘭植物組培苗的重要途徑之一，類原球莖的增殖速率和活力狀況對(duì)杜鵑蘭快繁技術(shù)體系至關(guān)重要。本研究篩選了基本培養(yǎng)基和不同激素濃度，繪制出類原球莖增殖生長(zhǎng)曲線，篩選出最適宜杜鵑蘭類原球莖增殖的條件。結(jié)果表明，選取生長(zhǎng)良好的白色或嫩綠色類原球莖，轉(zhuǎn)接入B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1+1.0 g·L-1活性炭+30.0 g·L-1土豆泥培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為45 d，增殖倍數(shù)最高達(dá)8.20倍。

在植物組織培養(yǎng)中，外植體極易出現(xiàn)褐化，其中杜鵑蘭植物的類原球莖就極易褐化而死亡。戴瑩等[14]在藥用植物組織培養(yǎng)褐化現(xiàn)象的研究進(jìn)展中提到，褐化主要分為由酶引起的褐化反應(yīng)和無(wú)酶引起的褐化反應(yīng)兩種情況。本研究中，杜鵑蘭植物類原球莖的褐化主要是酶促褐化，為此減少褐化是整個(gè)類原球莖增殖的核心。首先選用活力高幼嫩且健壯的白色或嫩綠色的類原球莖，采用減少傷口的接種方式，減少酚類物質(zhì)的釋放，并將傷口部位插入培養(yǎng)基中，隔絕氧氣，減少酶的產(chǎn)生；其次是適宜的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的濃度比例，對(duì)褐化有明顯的抑制作用[15]；最后是在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的活性碳，活性碳可以吸附植物在生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的酚類物質(zhì)[16]。