陳建國，孟慶楠，趙德梅，譚 謙

(基礎(chǔ)研究)

胰島素樣細(xì)胞生長因子-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子及轉(zhuǎn)化生長因子α對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖的影響

陳建國，孟慶楠，趙德梅，譚 謙

目的 表皮干細(xì)胞是組織工程化皮膚的“種子細(xì)胞”。文中研究堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣細(xì)胞生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor α，TGFα)對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖的影響。 方法 采用兩步酶消化法和Ⅳ型膠原差速貼壁相結(jié)合的方法獲得人原代表皮干細(xì)胞，將表皮干細(xì)胞分為A組(K-SFM)、B組(K-SFM+bFGF)、C組(K-SFM+IGF-1)及D組(K-SFM+TGFα)進(jìn)行培養(yǎng)。比較不同組之間表皮干細(xì)胞的克隆形成率、生長增殖、生長曲線和細(xì)胞周期等指標(biāo)。結(jié)論B組、C組及D組培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞在細(xì)胞增殖、細(xì)胞克隆率方面檢測(cè)結(jié)果均明顯高于A組(P＜0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)B組、C組與A組及D組處于G0/G1細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果IGF-1、bFGF及TGF-α均對(duì)表皮干細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，IGF-1及bFGF對(duì)表皮干細(xì)胞表型的維持有較好的作用。

胰島素樣細(xì)胞生長因子-1;堿性成纖維細(xì)胞生長因子;轉(zhuǎn)化生長因子α;表皮干細(xì)胞;增殖

0 引 言

表皮干細(xì)胞是組織工程化皮膚的“種子細(xì)胞”，但由于自體表皮干細(xì)胞的來源數(shù)量少，體外培養(yǎng)中細(xì)胞的大量擴(kuò)增是一個(gè)關(guān)鍵性的難題，并對(duì)組織工程化皮膚的臨床應(yīng)用產(chǎn)生了阻礙。本研究通過向培養(yǎng)基中分別添加bFGF、IGF-1和TGFα等不同的細(xì)胞因子，觀測(cè)表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性，獲得對(duì)表皮干細(xì)胞體外擴(kuò)增具有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子，以期為進(jìn)一步研究表皮干細(xì)胞體外大量擴(kuò)增提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 皮膚取自本院泌尿外科16～22歲行包皮環(huán)切術(shù)患者，患者無泌尿系統(tǒng)感染等疾病?；颊呔橥狻?shí)驗(yàn)試劑包括中性蛋白水解酶、胰蛋白酶+EDTA、Ⅳ型膠原(Sigma公司)，角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM)(Gibco公司)，PBS液、Ck19單克隆抗體、β1整合素單克隆抗體(博士德公司)，IGF-1、bFGF及TGFα(PeproTech公司)，CCK-8試劑盒(同仁公司)。

1.2 方法

1.2.1 表皮干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取得的新鮮包皮在含有青、鏈霉素的PBS液洗滌數(shù)次至洗滌液純凈，無菌條件下去除皮下組織，并將皮片剪成1cm× 1 cm大小，加入1U/ml中性蛋白水解酶，4℃冰箱過夜。次日，用 PBS液清洗3次，分離表皮和真皮。獲得的表皮放入0.05%胰蛋白酶+EDTA的消化液中，室溫消化5 min后終止消化，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，獲得角質(zhì)形成細(xì)胞懸液。將角質(zhì)形成細(xì)胞懸液800 r/min離心8min，離心半徑15cm。棄上清液，加入K-SFM5 ml，接種于已經(jīng)用Ⅳ型膠原包被過25 cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)約20 min，去除懸浮的細(xì)胞和雜質(zhì)，繼續(xù)孵箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞約70%～80%融合時(shí)，消化、收集細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105/ml，再接種在已包被Ⅳ型膠原的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 按添加細(xì)胞生長因子的不同分為4組，依次為A組(K-SFM)、B組(K-SFM+10 ng/ml bFGF)、C組(K-SFM+10 ng/ml IGF-1)、D組(K-SFM+10 ng/ml TGF-α)。

1.2.3 培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定 取生長良好的第2代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片。細(xì)胞生長達(dá)到適當(dāng)?shù)拿芏葧r(shí)，用冷丙酮4℃固定20min，PBS沖洗，按照博士德ABC免疫組化染色試劑盒說明進(jìn)行抗體的免疫組化染色。DAB顯色，室溫10 min，PBS洗中止顯色反應(yīng)，蘇木精襯染，逐級(jí)酒精脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。一抗為Ck19單抗及β1整合素單抗。

1.2.4 細(xì)胞生長曲線測(cè)定 取第2代生長良好的表皮干細(xì)胞，以2×103密度接種于96孔板中，分成4組，每組6孔，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基。用MTT法測(cè)定波長490 nm下A值，計(jì)算平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7次，未計(jì)數(shù)細(xì)胞換液1次/2 d。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成率的測(cè)定 取第2代表皮干細(xì)胞，按200個(gè)/孔接種至預(yù)先用Ⅳ型膠原包被過的24孔板中，分成4組并加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組6孔。培養(yǎng)1周后，記錄克隆數(shù)(細(xì)胞數(shù)≥50個(gè)記為1個(gè)克隆)。

1.2.6 細(xì)胞增殖的測(cè)定 利用CCK-8試劑盒檢測(cè)觀察培養(yǎng)第5天的細(xì)胞增殖情況，每種不同細(xì)胞因子每次測(cè)定6孔。取第2代表皮干細(xì)胞，按10000個(gè)/孔接種于96孔板，每組6孔，隔天換液，于第7天用CCK-8測(cè)定450 nm下A值。

1.2.7 細(xì)胞周期分析 0.25%胰酶 +0.02% EDTA消化，制備細(xì)胞懸液;PBS洗滌2次，70%乙醇4℃固定過夜，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，每組4個(gè)樣本。

2 結(jié) 果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 β1整合素、CK19免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的陽性表達(dá)，表明所培養(yǎng)細(xì)胞為表皮干細(xì)胞，見圖1。

圖1 培養(yǎng)的細(xì)胞CK19及β1整合素免疫組化染色(×200)Figure 1 Cultured cells stained by immunohistochemistry on CK19 and β-integrin(×200)

2.2 細(xì)胞生長曲線 從圖2可以看出，4組細(xì)胞的生長曲線均呈倒“S”形，細(xì)胞在第5天進(jìn)入倍增期。未添加細(xì)胞因子組ESC在第9天達(dá)到高峰。而所有添加細(xì)胞因子ESC組在第11天時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。

圖2 各組表皮干細(xì)胞的生長曲線Figure 2 The growth curve of the epidermal stem cells in different groups

2.3 細(xì)胞克隆形成率 A組細(xì)胞克隆形成率為(10.0±0.7)%，B組細(xì)胞克隆形成率為(14.0± 0.9)%，C組細(xì)胞克隆形成率為(13.7±0.6)%，D組細(xì)胞克隆形成率為(16.4±0.9)%。B、C及D組細(xì)胞克隆率明顯高于A組(P＜0.05);而D組細(xì)胞克隆率明顯高于B組及C組(P＜0.05);B組與C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 CCK-8檢測(cè)吸光度A值 第7天時(shí)，B、C及D組A值均明顯高于A組(P＜0.05);而D組高于B組及C組(P＜0.05);B組及C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組表皮干細(xì)胞第7天檢測(cè)的A值(，n=6)Table 1 The absorbance value of the epidermal stem cells in different groups at 7 d(，n=6)

表1 各組表皮干細(xì)胞第7天檢測(cè)的A值(，n=6)Table 1 The absorbance value of the epidermal stem cells in different groups at 7 d(，n=6)

與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，#P＜0.05

組別 A值A(chǔ)組0.502±0.006 B組 0.603±0.013*# C組 0.584±0.015*# D組 0.677±0.027*

2.5 細(xì)胞周期分析 B組及C組G0/G1細(xì)胞比例明顯高于A組及D組(P＜0.05);而B組與C組之間及A組與D組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組表皮干細(xì)胞細(xì)胞周期分析(，n=4)Table 2 The cell cycle of the epidermal stem cells in different groups(，n=4)

表2 各組表皮干細(xì)胞細(xì)胞周期分析(，n=4)Table 2 The cell cycle of the epidermal stem cells in different groups(，n=4)

與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，#P＜0.05

組別 G0/G1期細(xì)胞 G2/M期細(xì)胞 S 期細(xì)胞A組55.6±2.1 15.3±4.2 29.1±5.4 B組 62.8±2.4*# 6.5±2.3 30.8±2.6 C組 63.3±2.3*# 13.6±2.2 23.2±1.9 D組 56.0±1.0*6.9±2.6 37.1±2.7

3 討 論

表皮干細(xì)胞在皮膚的維護(hù)及修復(fù)中具有重要作用［1］。表皮干細(xì)胞是皮膚創(chuàng)傷修復(fù)再生理想的種子細(xì)胞，具有強(qiáng)大的可塑性，同時(shí)免疫原性較低，適合作為組織工程化皮膚的種子細(xì)胞［2－3］。目前多采用Rheinwald和Green［4］建立培養(yǎng)角質(zhì)化細(xì)胞的方法培養(yǎng)表皮干細(xì)胞［11］。但利用少量的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)增殖達(dá)到足夠數(shù)量的細(xì)胞較為困難，干細(xì)胞的自我更新及分化發(fā)育與其周圍的組織微環(huán)境密切相關(guān)［5－7］。

生長因子是指具有調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育的一類生物活性物質(zhì)。它們通過自分泌和旁分泌方式調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的增殖和分化，多種生長因子已證明對(duì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)具有作用。bFGF是一種肝素結(jié)合的多肽類絲裂源，廣泛分布于垂體、腦、神經(jīng)、視網(wǎng)膜、腎上腺和胎盤等組織中，可刺激多種細(xì)胞增殖［8］。IGF-1是一種類胰島素的細(xì)胞生長因子，具有促合成代謝作用，又有促生長作用的多肽，能增加葡萄糖和氨基酸的吸收，抑制蛋白質(zhì)降解，刺激各種細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)多種組織和細(xì)胞起有絲分裂源作用［9－10］。TGFα是與組織、細(xì)胞生長發(fā)育有關(guān)的一種促生長因子，可在多種組織和細(xì)胞中產(chǎn)生，以自分泌、旁分泌和鄰分泌的方式發(fā)揮作用，通過作用于細(xì)胞膜表皮生長因子受體發(fā)揮作用，刺激多種細(xì)胞合成DNA［11］。

通過改變培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子種類改變表皮干細(xì)胞生長的微環(huán)境可以影響細(xì)胞的增殖及表型的維持。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未添加細(xì)胞生長因子的表皮干細(xì)胞在第9天出現(xiàn)接觸抑制，而所有添加細(xì)胞生長因子的表皮干細(xì)胞則繼續(xù)增殖，第11天時(shí)才出現(xiàn)接觸抑制;另外CCK-8的檢測(cè)結(jié)果及細(xì)胞克隆率的檢測(cè)結(jié)果均表明添加細(xì)胞因子組細(xì)胞增殖能力明顯高于未添加細(xì)胞因子組細(xì)胞，這表明bFGF、IGF-1及TGFα均可促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖，且檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示TGFα效果最為顯著。細(xì)胞周期分析顯示，添加bFGF和IGF-1組G0/G1細(xì)胞比例明顯高于未添加細(xì)胞生長因子組，而添加TGFα組G0/G1細(xì)胞比例與未添加細(xì)胞生長因子組無明顯差異，從而表明bFGF和IGF-1在表皮干細(xì)胞表型維持方面有較好效果。

本研究結(jié)果證明，需要使更多表皮干細(xì)胞維持低分化狀態(tài)時(shí)宜應(yīng)用bFGF及IGF-1。而當(dāng)組織工程需要短時(shí)間獲得大量細(xì)胞時(shí)應(yīng)用bFGF、IGF-1及TGFα均可，但以TGFα效果較好。該結(jié)論可為組織工程化皮膚細(xì)胞的大量獲取提供依據(jù)。

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Effects of insulin-like growth factor-1，basic fibroblast growth factor and transforming growth factor α on the proliferation of human epidermal stem cells

CHEN Jian-guo，MENG Qing-nan，ZHAO De-mei，TAN Qian
(Department of Plastic and Burns，Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School，Nanjing210008，Jiangsu，China)

Objective Epidermal stem cells are"seed cells"of the tissue-engineered skin.We studied the effects of IGF-1，bFGF and TGF α on the proliferation of epidermal stem cells. Methods We obtained primary epidermal stem cells using the twostep enzyme digestion and type-IV collagen coated chosen methods.We cultured the epidermal stem cells in K-SFM(group A)，K-SFM+10ng/ml bFGF(group B)，K-SFM+10ng/ml IGF-1(group C)and K-SFM+10 ng/ml TGF-α(group D)，and compared their proliferation ability，cell growth curve，colony-forming rate and cell cycle in different media. Results The proliferation ability and colony-forming rate of the epidermal stem cells were significantly higher in groups B，C and D than in A(P＜0.05)，and so was the proportion of the cells of the G0/G1phase in groups B and C than in A and D(P＜0.05). Conclusion IGF-1，bFGF and TGF α promote the proliferation of epidermal stem cells，and IGF-1 and bFGF can effectively maintain their phenotype.

Insulin-like growth factor-1;Basic fibroblast growth factor;Transforming growth factor α;Epidermal stem cell; Proliferation

Q28

A

1008-8199(2012)08-0789-04

江蘇省"333高層次人才培養(yǎng)工程"科研項(xiàng)目(NJGL-2007116)

210008南京，南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院整形燒傷外科［陳建國(醫(yī)學(xué)碩士研究生)、孟慶楠、趙德梅、譚 謙］

譚 謙，E－mail:njtanqian@163.com

2012-04-12;

2012-06-29)

(責(zé)任編輯:聞 浩;英文編輯:羅永合)