南 英，韓香萍，路玲玲，向 榮，汪 洋

(基礎(chǔ)研究)

人淋巴瘤細(xì)胞株OCI-Ly19生物學(xué)特性研究和小鼠模型建立

南 英，韓香萍，路玲玲，向 榮，汪 洋

目的 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是成人淋巴瘤中最常見的病理類型。DLBCL分型對指導(dǎo)疾病的治療和預(yù)后有較大的意義，但各型DLBCL的發(fā)病機(jī)制及治療、預(yù)后尚還有待深入研究。文中探索DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly19的體外培養(yǎng)條件和生物學(xué)特性，腫瘤相關(guān)分子的表達(dá)及DLBCL動物模型的建立方法。 方法 觀察OCI-Ly19細(xì)胞生長形態(tài)及生物學(xué)特性，分析比較不同實(shí)驗(yàn)條件對細(xì)胞生長的影響，用流式細(xì)胞術(shù)分析相關(guān)抗原表達(dá)，將OCI-Ly19細(xì)胞皮下接種SCID小鼠，觀察腫瘤生長狀況及組織學(xué)形態(tài)。結(jié)論OCI-Ly19細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)條件下生長良好，多數(shù)重要的B細(xì)胞和腫瘤相關(guān)標(biāo)記物均有不同程度的表達(dá);未經(jīng)照射的SCID小鼠皮下接種107個OCI-Ly19細(xì)胞，成瘤率75%，組織學(xué)特征符合人類DLBCL的特點(diǎn)。結(jié)果獲得了OCI-Ly19細(xì)胞株體外培養(yǎng)的最佳條件及相關(guān)免疫標(biāo)志物表達(dá)情況。成功構(gòu)建了人DLBCL的小鼠模型，為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤;動物模型;細(xì)胞株;OCI-Ly19

0 引 言

DLBCL是成人淋巴瘤中最常見的病理類型［1］。根據(jù)免疫組化、基因表達(dá)譜及臨床資料，可將DLBCL分為2種類型，即生發(fā)中心B細(xì)胞(germinal center B cell，GCB)樣型和非 GCB樣型。GCB樣型的預(yù)后顯著優(yōu)于非 GCB樣型。雖然DLBCL分型對指導(dǎo)疾病的治療和預(yù)后均有較大的意義，但各型的發(fā)病機(jī)制及發(fā)病、治療和預(yù)后的相關(guān)因子尚有待于深入研究。DLBCL的動物模型為上述研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具［2］。在本研究中我們將人DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly19注入重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodefficirncy，SCID)小鼠，探索建立小鼠DLBCL模型的實(shí)驗(yàn)條件研究腫瘤生長和組織形態(tài)特點(diǎn)，分析培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的免疫標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動物 人源性GCB樣DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly19［3］，由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院陳軍教授惠贈。細(xì)胞置于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、30 μg/ml谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物選用5周齡、體重15 g左右的雌性SCID小鼠，購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物繁育中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SYXK(津) 2008－0005。小鼠的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在保持恒溫(20～26℃)、恒濕(50%～56%)的無持定病原體(specefic pathoger free，SPF)級鼠房內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前不經(jīng)照射等任何處理，實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)分組。

1.2 細(xì)胞接種 取處于對數(shù)生長期的OCI-Ly19細(xì)胞，用無血清PBS漂洗2遍并懸浮于無血清PBS中，實(shí)驗(yàn)組小鼠每只右側(cè)肋下接種107個細(xì)胞。

1.3 小鼠觀察和處理 每天觀察小鼠的一般狀況，成瘤及腫瘤生長情況。每天測量小鼠體重和腫瘤長短徑和高度，并計(jì)算腫瘤體積，計(jì)算方法為長×寬×高［3］。當(dāng)瘤體達(dá)到2 000 mm3時視為人道終點(diǎn)。小鼠經(jīng)麻醉并拉頸處死，觀察體表及各內(nèi)臟器官成瘤情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。瘤體置于10%中性甲醛溶液中固定。

1.4 病理組織學(xué) 將甲醛固定后的腫瘤組織制作石蠟切片，HE染色觀察。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 取體外培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的OCI-Ly19細(xì)胞用PBS漂洗2遍后，置于含2% FBS的PBS中制備1×107cells/ml細(xì)胞懸液，加入相應(yīng)抗體后于4℃避光孵育15 min。對仍需細(xì)胞內(nèi)染色的細(xì)胞在表面抗原染色后立即用1%多聚甲醛固定，然后用0.25%皂甙(saponin)處理并加抗體染色，4℃避光孵育過夜。然后將細(xì)胞用含2%FBS的PBS漂洗并懸于200 μl PBS中待測。用美國Becton Dickinson公司的FACScan流式細(xì)胞儀檢測樣品，每份樣品均測定2～3×105細(xì)胞，并采FlowJo軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。檢測中采用10種抗體:CD19/APC (BD Pharmingen)、CD20/PE(BD Pharmingen)、CD24/ PE(BD Pharmingen)、CD38/PE(eBioscience)、c-Met/ FITC(eBioscience)、CD81/FITC(Santa Cruz)、Ki-67/ FITC(eBioscience)、Bcl-2/purified(Abcam)、survivin/ purified(Abcam)。Bcl-2及survivin的二抗為山羊抗兔IgG/FITC(eBioscience)。

2 結(jié) 果

2.1 OCI-Ly19細(xì)胞體外培養(yǎng)特性

2.1.1 細(xì)胞生長形態(tài)觀察 正常OCI-LY19細(xì)胞大小均勻，呈圓形或卵圓形，透光度較好，核大，可見明顯的核仁，大多位于細(xì)胞核的周邊。在培養(yǎng)基中懸浮生長，復(fù)蘇后呈單個懸浮細(xì)胞，靜置培養(yǎng)約4 h后，細(xì)胞開始成團(tuán)生長，約10～13個細(xì)胞，見圖1a。隨靜置培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞團(tuán)塊增大，團(tuán)塊中細(xì)胞數(shù)量增加。當(dāng)團(tuán)塊過大，含有30～40個以上細(xì)胞，位于中間位置的細(xì)胞由于缺乏營養(yǎng)，表面僵硬、皺縮，透光度減少，最終死亡，見圖1b。因此，每隔10 h左右須晃動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞團(tuán)塊散開。細(xì)胞用10%含20%FCS的DMSO凍存，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率均在90%以上。

2.1.2 不同濃度血清對OCI-Ly19細(xì)胞生長的影響本OCI-Ly19細(xì)胞體外培養(yǎng)均采用HyClone公司的RPMI1640培養(yǎng)基及Gibco公司的澳洲FBS。分別采用不同濃度(5%、10%和15%)FBS培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，采用10%FBS培養(yǎng)，細(xì)胞在第2天進(jìn)入指數(shù)生長期，第4天達(dá)到生長高峰，細(xì)胞數(shù)由初始的106增至5×107，其生長速度和傳代周期適中;細(xì)胞生長狀態(tài)良好，活力旺盛，接種的動物成瘤率較高。不同血清濃度下細(xì)胞生長曲線如圖1c。

圖1 OCI-Ly19細(xì)胞培養(yǎng)Figure 1 Culture of OCI-Ly19 cells

2.2 動物模型的構(gòu)建和觀察

2.2.1 成瘤率和成瘤部位 皮下注射107個細(xì)胞的8只SCID小鼠中，6只成瘤，成瘤率75%。成瘤小鼠均在右側(cè)肋部皮下形成瘤塊，與注射部位一致。體表未見其他部位成瘤。解剖后仔細(xì)觀察全身淋巴結(jié)、各臟器及皮下組織，均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。且瘤組織被覆完整包膜，其周圍組織未見浸潤。成瘤小鼠與其他未成瘤小鼠或正常組小鼠相比，均出現(xiàn)行動緩慢、精神萎靡、豎毛、易激惹、易驚嚇等癥狀。小鼠體重變化曲線見圖2a。

2.2.2 成瘤時間及腫瘤生長 6只成瘤小鼠的成瘤時間為(25.2±1.7)d。腫瘤生長曲線如圖2b。

圖2 腫瘤模型的建立Figure 2 Establishment of a DLBCL model in mice a:荷瘤小鼠和正常小鼠體重變化曲線;b:腫瘤生長曲線

2.2.3 腫瘤外觀 在6只成瘤小鼠右側(cè)肋部皮下可見1個瘤結(jié)節(jié)，為扁丘狀實(shí)體，圓形或卵圓形，中部凸起，見圖3a。解剖取材時見瘤組織質(zhì)地柔韌，表面被覆完整結(jié)締組織包膜，邊界清晰，與周圍組織無粘連，可見豐富的新生血管長入瘤組織，見圖3b。

圖3 腫瘤外觀Figure 3 Tumors in SCID mice induced by subcutaneous injection of OCI-Ly19 cells

2.3 腫瘤的組織學(xué)檢查 瘤組織切面呈魚肉樣質(zhì)地，色粉紅。其中心部未發(fā)生出血、壞死，不伴有纖維化。切片HE染色可見瘤細(xì)胞大小較一致，細(xì)胞呈圓形或卵圓形，彌漫性分布，細(xì)胞質(zhì)少，核大、深染，核內(nèi)可見多個清晰核仁。可見豐富的新生血管，見圖4a和核分裂相，見圖4b。

圖4 腫瘤組織學(xué)表現(xiàn)Figure 4 Histology of DLBCL

2.4 OCI-Ly19細(xì)胞的表面抗原 OCI-Ly19細(xì)胞在DLBCL分型中屬于GCB亞型［3］，表現(xiàn)為CD10+/bcl-6+。其中CD19+占99.5%以上。本研究流式細(xì)胞術(shù)分析首先以CD19設(shè)門，以排除背景干擾，見圖5a。

2.4.1 B細(xì)胞或腫瘤相關(guān)標(biāo)志物 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測OCI-Ly19細(xì)胞表面B細(xì)胞或腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)，共檢測3次。CD20、CD24、CD38和CD81的陽性率分別為(75.3±7.0)%、(51.5±7.3)%、(98.5±1.2)%和(50.3±19.2)%。圖5b示1次流式細(xì)胞術(shù)檢測的結(jié)果。

圖5 腫瘤細(xì)胞的流式檢測Figure 5 FACS analysis of OCI-Ly19 cells

2.4.2 細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志物 對OCILy19細(xì)胞表面與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行了3次獨(dú)立流式細(xì)胞術(shù)檢測分析，陽性率和平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)結(jié)果見表1。

表1 腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)Table 1 Expressions of proliferation-and apoptosis-associa ted markers in OCI-Ly19 cells

3 討 論

DLBCL的形態(tài)學(xué)、病理組織學(xué)及臨床表現(xiàn)上有明顯的異質(zhì)性，免疫表型與預(yù)后的關(guān)系十分密切。研究與DLBCL預(yù)后相關(guān)的因素對疾病的診斷分型、臨床治療和預(yù)后評估都具有重要意義［4］。基因表達(dá)譜的差異導(dǎo)致DLBCL的異質(zhì)性，并影響疾病的預(yù)后。由于技術(shù)條件的限制，基因表達(dá)譜分析難以在臨床廣泛應(yīng)用。Hans等［5］于2004年首次應(yīng)用免疫組化方法根據(jù)細(xì)胞表面CD10、bcl-6和MUM-1的表達(dá)對DLBCL分型。免疫組化分型方法與基因表達(dá)譜分型方法相比，符合率達(dá)到80%以上，已為臨床普遍接受，并于2008年被WHO造血和淋巴組織腫瘤分類方案推薦使用［6］。DLBCL細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)對DLBCL的診斷分型和臨床治療及預(yù)后評估均具有重要意義。目前大量研究致力于尋找對評價(jià)DLBCL患者生存和預(yù)后具有指導(dǎo)意義的相關(guān)因素，包括基因表達(dá)和免疫組化的細(xì)胞表面標(biāo)志。

本研究用免疫組化方法檢測了體外培養(yǎng)的人類來源的DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly19的細(xì)胞表面標(biāo)志物。OCI-Ly19屬于GCB亞型，幾乎全部表達(dá)CD19。CD20在B細(xì)胞活化中起重要作用，前B細(xì)胞直至分化到前漿細(xì)胞均表達(dá)CD20。應(yīng)用抗CD20單克隆抗體Rituximab(商品名為美羅華)，聯(lián)合傳統(tǒng)化療可使DLBCL患者的長期生存率提高10%以上。本研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的OCI-Ly19細(xì)胞CD20表達(dá)率達(dá)75%以上。CD24參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖和成熟。CD38在調(diào)控細(xì)胞生長和分化中發(fā)揮重要作用，在未成熟B細(xì)胞中高水平表達(dá)。CD81表達(dá)于正常的生發(fā)中心B細(xì)胞和GCB型DLBCL細(xì)胞。上述B細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在OCI-Ly19細(xì)胞中均有較高表達(dá)，尤其是CD38的陽性表達(dá)率達(dá)98%以上，提示大部分細(xì)胞處于活化和增殖活躍的狀態(tài)。

原癌基因c-Met編碼的蛋白具有酪氨酸激酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和運(yùn)動，多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中均有c-Met過度表達(dá)［7］。Ki-67與細(xì)胞增殖特異性有關(guān)，主要用于判斷細(xì)胞增殖活性［8］。在DLBCL中，Ki-67細(xì)胞陽性率反映增生細(xì)胞的百分率。bcl-2在細(xì)胞凋亡中起重要的調(diào)控作用，是細(xì)胞凋亡的重要抑制性因素。在DLBCL中bcl-2高表達(dá)較為常見，約30%～60%的DLBCL病例表達(dá)bcl-2［5］。存活蛋白(survivin)也屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族，多數(shù)DLBCL細(xì)胞均有表達(dá)［9］。近年有研究者發(fā)現(xiàn)survivin還與鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤具有高度相關(guān)性［10］。本研究結(jié)果顯示，上述與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的標(biāo)志物在體外培養(yǎng)的人DLBCL細(xì)胞中雖有表達(dá)，但陽性率遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的臨床標(biāo)本，約為臨床標(biāo)本陽性率的50%左右。這種現(xiàn)象很可能與缺乏體內(nèi)和腫瘤微環(huán)境中多種因素的作用有關(guān)。在本研究的基礎(chǔ)上，我們已對相關(guān)的免疫標(biāo)志物接種前后的表達(dá)進(jìn)行對比研究。

DLBCL的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)多種因素密切相關(guān)，體外DLBCL細(xì)胞株培養(yǎng)難以正確模擬DLBCL的生物學(xué)行為。淋巴瘤動物模型分為自發(fā)性、誘發(fā)性、轉(zhuǎn)基因和移植性等多種類型。自發(fā)性淋巴瘤動物模型的成瘤時間長，均一性差。誘發(fā)性和轉(zhuǎn)基因模型存在拷貝數(shù)的不可控性及結(jié)合位點(diǎn)的隨機(jī)性等缺點(diǎn)。移植性模型可較好地保持所種植的人淋巴瘤的組織學(xué)特點(diǎn)，因而我們選用種植人類來源的DLBCL細(xì)胞構(gòu)建動物模型。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用OCI-Ly19細(xì)胞可成功建立人DLBCL的小鼠模型，其組織學(xué)特征符合人DLBCL的特點(diǎn)，穩(wěn)定性和重復(fù)性均較為理想。皮下注射方法簡單，成瘤率高，較易復(fù)制，已廣泛應(yīng)用于研究人類腫瘤的免疫遺傳特點(diǎn)及抗腫瘤藥物的療效［11］。由于SCID小鼠體內(nèi)尚殘留較強(qiáng)的非特異性免疫活性，在移植腫瘤前常予以全身輻射，以殺傷小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞，提高移植瘤的成活率。本研究中接種OCI-Ly19細(xì)胞的SCID小鼠未作照射處理，仍具有較高的成瘤率，分析其原因應(yīng)與接種的腫瘤細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)有關(guān)。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，良好的生長狀態(tài)和足夠的細(xì)胞數(shù)(不少于107)是獲得高成瘤率的重要條件。本研究采用SCID小鼠建立人DLBCL腫瘤模型，是由于SCID小鼠體內(nèi)缺乏成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞，有利于采用人類來源的淋巴細(xì)胞再灌注建立人源化動物模型，深入研究抗腫瘤的免疫反應(yīng)［12］。

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Human diffuse large B-cell lymphoma cell line OCI-Ly19:Biological characteristics and establishment of a mouse model

NAN Ying1，HAN Xiang-ping2，LU Ling-ling1，XIANG Rong1，WANG Yang1
(1.Laboratory of Molecular Virology and Viral Immunology of School of Medicine，2.Department of Biochemistry and Molecular Biology of School of Life Sciences，Nankai University，Tianjin300071，China)

Objective Diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)is a most common pathological type of lymphoma in adults.The typing of DLBCL helps a lot the treatment and prognosis of the disease，and deeper studies are needed on the pathogenesis，management and prognosis of different types of DLBCL.The aim of this study was to investigate the in vitro culture conditions and biological characteristics of OCI-Ly19 cells of human DLBCL，the expression of tumor-associated molecules and the establishment of an animal model of human DLBCL. Methods We observed the histological and biological characteristics of OCI-Ly19 cells under different culture conditions，analyzed the expressions of B-cells and tumor-related markers by flow cytometry，and observed the formation and histology of tumors following subcutaneous injection of OCI-Ly19 cells into SCID mice. Results OCI-Ly19 cells grew well under appropriate culture conditions.Flow cytometry showed high expressions of B-cells and tumor-related markers(50%－98%)and median expressions of proliferation-and apoptosis-related markers(20%－53%)of the cultured OCI-Ly19 cells.Subcutaneous injection of 107 OCI-Ly19 cells into the SCID mice produced 75%of tumor formation with the characteristics of human DLBCL. Conclusion We obtained most appropriate conditions for the in vitro culture of OCI-Ly19 cells and the expressions of relevant immune markers，and successfully established a mouse model of human DLBCL.

Diffuse large B-cell lymphoma;Animal model;Cell line;OCI-Ly19

R733

A

1008-8199(2012)08-0793-05

天津市科委中國瑞典合作重大項(xiàng)目(09ZCZDSF04000)

300071天津，南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病毒和病毒免疫實(shí)驗(yàn)室［南 英(醫(yī)學(xué)碩士研究生)、路玲玲、向 榮、汪 洋］，南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)和分子生物學(xué)系［韓香萍(生理學(xué)碩士研究生)］

汪 洋，E－mail:yangwang@nankai.edu.cn

2011-05-25;

2011-07-01)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:羅永合)