曾家豫，趙靜，孔維寶，劉雄雄，武偉國，葸玉琴，楊紅

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

紅三葉草(紅三葉，T.pratense)又名“紅車軸草”、“紅荷蘭翹搖”，屬多年生草本植物［1］，分布于歐洲、美國及新西蘭，中國淮河以南亦有栽培。紅三葉草是畜禽的優(yōu)質(zhì)飼料，產(chǎn)草量高，可用于發(fā)展畜牧業(yè)。含有多種異黃酮類物質(zhì)，占其干重的0.5% ～3.5%［2］，高于其他豆類10～30倍。紅三葉草及其制劑具有防治乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和改善骨質(zhì)疏松［3-4］、以及女性更年期癥狀等作用［5-6］，是極有前途的天然保健食品［7］。

紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水是為了提取紅三葉草中的異黃酮類物質(zhì)［8-9］，將新鮮的紅三葉草通過一系列機(jī)械擠壓和清洗等操作而加工成紅三葉草干草的過程中產(chǎn)生的廢水，目前，這些廢水大多直接排放，不僅污染環(huán)境，而且浪費(fèi)資源。因此，如何對其進(jìn)行凈化處理和有效利用成為亟待解決的問題。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制劑是當(dāng)前應(yīng)用最廣、最有效的微生物殺蟲劑［10］。Berliner［11］于1911年首先從德國地帶的一批被感染的地中海粉螟中分離得到該菌，屬于革蘭氏陽性土壤桿菌，在芽孢形成過程中產(chǎn)生稱為δ-內(nèi)毒素的殺蟲伴孢晶體蛋白，具有很高的殺蟲活性［12-13］。同時，研究人員發(fā)現(xiàn)，其在芽孢形成前的營養(yǎng)生長階段，可分泌另外一種非δ-內(nèi)毒素的殺蟲蛋白，即Vip蛋白(vegetative insecticidal protein)，它是很有應(yīng)用前景的殺蟲蛋白，被稱為第二代殺蟲蛋白［14-15］。

本文以紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水為原料，制備蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌。以期探索研究一種紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水凈化處理和資源化利用的新方法。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水，取自甘肅岷縣方正草業(yè)開發(fā)有限公司。

ACCC01607-蘇云芽孢桿菌(Bt)，購于廣東微生物所菌種保藏中心;牛肉膏，酵母粉，蛋白胨，瓊脂;葡萄糖、NaCl、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3等，均為分析純試劑。

1.2 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨 5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，儲存?zhèn)溆谩?/p>

種子液體培養(yǎng)基:蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g，用預(yù)處理后的紅三葉草廢水作為溶劑定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，儲存?zhèn)溆谩?/p>

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:預(yù)處理后的紅三葉草預(yù)加工廢水，調(diào)節(jié)起始pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，儲存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵培養(yǎng)基:由預(yù)處理后的紅三葉草預(yù)加工廢水，按不同比例補(bǔ)加(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4和CaCl2等營養(yǎng)成分。

1.3 儀器

U-1800型紫外可見分光光度計(jì)，日產(chǎn)日立;TGL-5000B低溫冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;HHS-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;pH計(jì)，Thermo Orion;BS224S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;XD電熱恒溫干燥箱，天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠;凱氏定氮儀(KDY-9810型)。

2 方法

2.1 紅三葉草鮮青草預(yù)加工廢水的處理

取紅三葉草加工廢水2 000 mL過濾，濾液于120℃加熱處理10 min，冷卻至室溫，靜置3 h，3 000 r/min離心5 min，得上清液，即可作為微生物基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，或作為培養(yǎng)基基液補(bǔ)加營養(yǎng)成分后制備微生物發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 菌種活化和保藏

在無菌條件下，取少量菌種干粉，于1 mL無菌水中浸泡15 min，涂平板于瓊脂培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)48 h。儲存于4℃冰箱待用，每3～6個月轉(zhuǎn)接1次。

2.3 種子液的培養(yǎng)

在250 mL錐形瓶中，加入100 mL種子液體培養(yǎng)基，接種1～2環(huán)活化的菌株，120 r/min，30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h。

2.4 蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

在1000 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種一定量種子液后，于120 r/min，30℃下?lián)u床培養(yǎng)48 h。在每一組實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件依具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而變化。

2.5 蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用Plackett-Burman［16］實(shí)驗(yàn)篩選影響蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵的主要因素;根據(jù)各主要因素的效應(yīng)大小確定它們的變化方向及步長，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，確定蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵的最優(yōu)條件所在區(qū)域的中心點(diǎn);根據(jù)最優(yōu)條件所在區(qū)域的中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)Box-Benknken實(shí)驗(yàn)，并對其結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定蘇云金芽孢桿菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。

2.6 分析檢測方法

蛋白含量的測定:采用凱氏定氮法［17］測定。

總糖含量的測定:采用蒽酮比色法［18］測定。

Bt生物量的測定:通過差量法測定干細(xì)胞的重量。取5 mL發(fā)酵液于5 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀物用蒸餾水沖洗2～3次，再離心后于105℃下烘干至恒重。以未發(fā)酵的培養(yǎng)基作為對照，操作方法相同。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析:采用 Design-expert7.0(STAT-EASE inc.，Minneapolics，USA)軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)參數(shù)以標(biāo)準(zhǔn)方差來評價。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水的處理

檢測結(jié)果顯示(表1):基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(上清液)中，蛋白質(zhì)含量為 0.437 g/L，總糖的含量為0.129 g/L，可基本滿足Bt生長所需的碳源和氮源要求。另外，該發(fā)酵培養(yǎng)基為紅三葉鮮青草在預(yù)加工過程中經(jīng)擠壓和清洗等操作而產(chǎn)生的水溶液，其中還含有色素、維生素和無機(jī)鹽等成分，可作為Bt生長的營養(yǎng)物質(zhì)。

表1 原廢水和廢水上清液的主要組成 g/L

3.2 影響蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵主要因素的篩選

以9個因素為評價對象，每個因素取高(+1)和低(-1)2個水平，9個因素間的組合共12組實(shí)驗(yàn)，Plackett-Burman(PBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。以一階模擬方程來評價9個因素的作用效果。一階回歸方程為:

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果

其中，Y代表預(yù)測響應(yīng)值，β0和βi代表線性系數(shù)，xi代表單個因子。PBD實(shí)驗(yàn)擬合的一階回歸方程為:

Y=4.39+0.80X1+0.26X2+0.19X3-0.43X4+0.37X5+0.94X6-0.33X7+1.19X8+0.047X9

其中，Y—Bt生物量(g/L);X1-(NH4)2SO4(g/L);X2-KH2PO4(g/L);X3-MgSO4(g/L);X4-CaCl2(g/L);X5-MnSO4(g/L);X6-起始pH;X7-溫度(℃);X8-發(fā)酵時間(h);X9-接種量［%(V/V)］。

在一階模擬方程中，相關(guān)系數(shù)R2為0.979 6，接近98%，因而可用此一階回歸方程來解釋響應(yīng)值隨各個因素的變化。

PBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表3所示。發(fā)酵時間、起始pH和(NH4)2SO4濃度對應(yīng)的P值均小于0.05，因此它們是影響B(tài)t生物量的主要因素。

表3 一階回歸方程方差分析

3.3 影響蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵主要因素最佳值所在區(qū)域中心點(diǎn)的確定

在PBD實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用最陡爬坡設(shè)計(jì)(SAD)來確定3個主要因素的變化方向?qū)t生物量生成的影響以及它們的最佳值所在區(qū)域的中心點(diǎn)，SAD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表4所示。由表4可知，當(dāng)發(fā)酵時間72 h、起始pH 7.0和(NH4)2SO4濃度為3.0 g/L時，Bt生物量最大(8.34 g/L)，表明此條件已接近于最優(yōu)。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

3.4 蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵最優(yōu)條件的確定

在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)確定3個主要因素的最優(yōu)水平。每個因素設(shè)計(jì)5個水平(-1.682，-1，0，+1，+1.682)，3 個主要因素間的組合共20組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表5和表6所示。以二階模擬方程來評價3個主要因素的作用效果。二階回歸方程為:

Y= β0+∑βixi+∑βiixi2+∑βijxiyi

其中，Y代表預(yù)測響應(yīng)值，xi和yi代表單個因子，β0和βi代表線性系數(shù)，βii和βij代表二階回歸系數(shù)。BBD實(shí)驗(yàn)擬合的二階回歸方程為:

Y=8.42+0.13A+0.27B+0.52C－0.056AB－0.034AC+0.14BC－0.78A2－0.44B2－0.71C2

其中，Y—Bt生物量(g/L);A-發(fā)酵時間(h);B-起始pH;C-(NH4)2SO4濃度(g/L)。

在二階模擬方程中，相關(guān)系數(shù)R2為0.9572。通常，R2＞0.9000就表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很高的相關(guān)性，所以，此R2值反映實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值間有很好的擬合，用該二階回歸方程描述響應(yīng)值隨主要因素的變化趨勢是合理的。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表7所示。該模型對應(yīng)的P值小于0.05，表明用該模型描述3個主要因素與Bt生物量間的相關(guān)性是顯著的。

表7 二階回歸方程方差分析

最后，用三維響應(yīng)曲線來解釋各變量之間的相互作用并確定當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到最大時各因素的最優(yōu)水平，三維響應(yīng)曲線如圖1～圖3所示。每個圖表示其它因素處于固定值時3個主要變量中任意2個之間的相互作用對Bt生物量生成的影響。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵時間為66.71 h，起始pH為7.36和(NH4)2SO4濃度為3.08 g/L時，Bt生物量達(dá)到最大值8.57 g/L。

圖1 發(fā)酵時間和起始pH間相互作用對Bt生物量生成的響應(yīng)曲線

3.5 最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了利用紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水培養(yǎng)Bt的最佳條件:起始pH為7.36，發(fā)酵時間為66.71 h，溫度為30℃，接種量為7.5%(v/v)，(NH4)2SO4濃度為 3.08 g/L，KH2PO41.0 g/L，Mg-SO40.25 g/L，CaCl20.15 g/L，MnSO40.5 g/L。為了確定該研究結(jié)果是否準(zhǔn)確，在3 L發(fā)酵罐中于最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)Bt。結(jié)果顯示，所得Bt生物量的平均值為8.57 g/L，與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值(8.42 g/L)相吻合。這表明響應(yīng)模型基本準(zhǔn)確。

圖2 發(fā)酵時間和(NH4)2SO4濃度間相互作用對Bt生物量生成的響應(yīng)曲線

圖3 起始pH和(NH4)2SO4濃度間相互作用對Bt生物量生成的響應(yīng)曲線

圖4 最優(yōu)條件下Bt生長曲線和發(fā)酵液pH變化

圖4 為最優(yōu)培養(yǎng)條件下Bt的生長曲線和發(fā)酵液pH值的變化情況。由圖4可知，在0～72 h時，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液pH逐漸增加;發(fā)酵時間超過72 h后，發(fā)酵液pH保持在8.5左右。隨著發(fā)酵時間的延長，Bt生物量逐漸增加，到72 h左右時達(dá)到最大值。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面優(yōu)化法可快速篩選以紅三葉草加工廢水為原料培養(yǎng)Bt時影響生物量生成的顯著因素，并通過建立多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，采用統(tǒng)計(jì)分析對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)來優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為起始pH為7.36，發(fā)酵時間為66.71 h，溫度為30℃，接種量為7.5%(V/V)，(NH4)2SO4濃度3.08 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.25 g/L，CaCl20.15 g/L，MnSO40.5 g/L，在此最優(yōu)條件下，Bt生物量可達(dá)到8.57 g/L，是以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生生物量的1.2倍。因此，可利用紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水為原料培養(yǎng)Bt，達(dá)到了廢物處理和合理利用資源的目的。

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