蘆丁的酶法轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物異槲皮苷的分離

吳 迪,劉廷強(qiáng),王東明,金鳳燮,魚紅閃

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

蘆丁的酶法轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物異槲皮苷的分離

吳 迪,劉廷強(qiáng),王東明,金鳳燮,魚紅閃

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

利用微生物Absidia sp.R9g產(chǎn)的蘆丁-α-鼠李糖苷酶(RhaR)轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮苷,采用硅膠柱層析法對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明,24.0 g蘆丁的酶解產(chǎn)物,經(jīng)分離可得到較純的異槲皮苷單體13.1 g,其得率為49.4%。通過高效液相色譜檢測其純度達(dá)到98.3%。

蘆丁-α-鼠李糖苷酶；酶轉(zhuǎn)化；異槲皮苷

0 引 言

異槲皮苷屬于黃酮類物質(zhì),是蘆丁的衍生物,僅比蘆丁少一個鼠李糖,但其藥理活性卻明顯高于蘆丁。異槲皮苷具有抗炎、抗氧化、抗誘變等多種藥理作用[1-2],并可有效地用于防治高血壓、糖尿病、冠心病及神經(jīng)衰弱等疾病[3]。異槲皮苷雖然在植物中分布較廣[4],但是在這些植物中的含量卻極低,如果從植物中直接提取,工作量較大、且得率較低,從而極大地限制了人們對其進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。因此如何大量制備異槲皮苷成為了該研究領(lǐng)域的重要課題。

傳統(tǒng)的工業(yè)化生產(chǎn)一般采用強(qiáng)酸對蘆丁進(jìn)行水解[5],該法不利于環(huán)境保護(hù),且很難控制中間產(chǎn)物異槲皮苷的生成。另有研究從植物生物質(zhì)中提取和純化黃酮類物質(zhì),但此法需要昂貴的生物酶制劑,且工藝設(shè)備較復(fù)雜,生產(chǎn)成本高。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選出一種微生物菌株[6],該微生物能產(chǎn)生一種鼠李糖苷酶。此酶能夠?qū)Ｒ桓咝У厮馓J丁分子上的鼠李糖基,生成產(chǎn)物異槲皮苷。此方法操作簡單安全,并且整個過程反應(yīng)便于控制,能大量生成中間產(chǎn)物異槲皮苷,產(chǎn)出量大,且產(chǎn)物純度高。因此,利用酶法轉(zhuǎn)化自然界中廣泛存在且含量較高的蘆丁,大量制備天然含量低、附加值高的異槲皮苷單體,具有重要意義,可以廣泛應(yīng)用于食品和工業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材 料

蘆丁、槲皮素、異槲皮苷樣品,美國Sigma公司；菌種Absidia sp.R9g,大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏所；薄層層析板(TLC),德國Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶液的制備

液體培養(yǎng)基配方：在12%的槐花浸出液中加入48%的麥芽汁,其余的40%用水補(bǔ)齊,最終制成麥芽汁濃度為5°的RhaR液體發(fā)酵培養(yǎng)基,121℃下濕熱滅菌。

將Absidia sp.R9g接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為1～2環(huán)。然后將其置于全溫振蕩器中,在30℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)菌體4～5 d。取發(fā)酵好的6 000 m L發(fā)酵液,用高速冷凍離心機(jī)在7 000 r/min下離心10 min,進(jìn)而去除菌體,收集上清液；使用磁力攪拌儀,緩慢加入硫酸銨粉末至80%飽和度,在4℃下靜置3～4 h；再離心,棄上清,收集蛋白質(zhì)沉淀；沉淀用600 m L的0.02 mol/L pH 5.0的 HAc-Na Ac緩沖液溶解,在7 000 r/min下離心10 min,所得上清液即為粗酶液。

1.2.2 酶活力的測定

配制 10 mg/m L(0.02 mol/L pH 5.0 的HAc-Na Ac緩沖液0.8 m L加95%乙醇0.2 m L)的蘆丁底物溶液,取0.1 m L底物溶液與0.1 m L粗酶液混合,50℃進(jìn)行酶解反應(yīng)8 h,然后加入0.2 m L的水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)；振蕩、分層,取上層液作薄層層析檢測,點(diǎn)樣量為10μL,通過展開劑展開后在紫外下顯色檢測,應(yīng)用Bandscan工具軟件進(jìn)行產(chǎn)物含量分析。

酶活力單位定義：在上述條件下,每小時生成1μg異槲皮苷的酶量為一個酶活力單位。

1.2.3 蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)組前期對該粗酶液進(jìn)行了酶反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定最佳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、最佳反應(yīng)時間為8 h、最佳反應(yīng)溫度為50℃、最佳pH為5.0。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng),準(zhǔn)確稱量24.0 g蘆丁,加入480 m L 0.02 mol/L pH 5.0的HAc-Na Ac緩沖溶液和120 m L 95%的乙醇。然后加入600 m L酶液,混合后置于恒溫50℃的反應(yīng)釜中,攪拌反應(yīng)8 h后終止酶反應(yīng)。將反應(yīng)液在7 000 r/min下高速冷凍離心10 min,然后對上清液進(jìn)行濃縮、干燥,得到粗產(chǎn)品。反應(yīng)后將酶液回收,重復(fù)進(jìn)行5次酶反應(yīng)以大量制備異槲皮苷。

1.2.4 產(chǎn)物異槲皮苷的分離純化

利用硅膠柱層析對酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。首先制備樣品膠,將蘆丁酶轉(zhuǎn)化的酶解產(chǎn)物混合樣品用于上樣,用200 m L甲醇完全溶解。加入3倍樣品質(zhì)量的80～100目的硅膠,攪拌至顆粒均勻,在通風(fēng)櫥中的水浴鍋上加熱揮發(fā)至完全干燥。將厚度均勻的脫脂棉置于玻璃柱(φ8.2 cm×20 cm)底端,先裝入15倍樣品質(zhì)量的300～400目的分離膠,抽真空使柱面平整,然后裝入已經(jīng)干燥好的樣品膠,并于柱頂覆一層脫脂棉,保持柱面平整。最后對其進(jìn)行洗脫,首先用純氯仿打通硅膠柱,再用氯仿-甲醇洗脫劑(體積比為9.2∶0.8)對其進(jìn)行洗脫,每次洗脫250 m L,由TLC檢測監(jiān)控洗脫過程,最后用純甲醇將柱上殘留的組分洗脫下來。洗脫完畢根據(jù)TLC檢測結(jié)果,分類合并相同組分,將其濃縮干燥,稱重。

1.2.5 高效液相色譜(HPLC)檢測

采用高效液相色譜(HPLC)法對產(chǎn)品異槲皮苷進(jìn)行純度檢測。色譜儀為Waters 2695高效液相色譜分析儀,利用 Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower色譜工作站對蘆丁水解產(chǎn)物進(jìn)行純度檢測。其中色譜條件為：中匯達(dá)的Kromasil C18反相色譜柱(φ4.6 mm×250 mm)；檢測波長265 nm；體積流量1.0 m L/min；進(jìn)樣量10μL；柱溫35℃。流動相為55%甲醇、45%水和0.4%的H3PO4混合液。

1.2.6 薄層層析(TLC)檢測

將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶于甲醇中,用微量點(diǎn)樣器吸取少量溶液,少量多次點(diǎn)在硅膠薄層層析板的起始線上,每次點(diǎn)樣經(jīng)電吹風(fēng)風(fēng)干后,將其置于盛有展開劑的層析缸中展開。當(dāng)展開劑到達(dá)層析板上緣時,取出吹干表面溶劑,置于紫外分析儀中觀察結(jié)果。參照標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)位置確定樣品中所含成分。所用展開劑的體積比為V(乙酸乙酯)∶V(丁酮)∶V(甲醇)∶V(水)＝10∶7∶1∶1。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)

菌種Absidia sp.R9g經(jīng)5 d恒溫培養(yǎng),80%的硫酸銨粉末沉淀,沉淀經(jīng)0.02 mol/L pH 5.0的HAC-Na AC緩沖液溶解得到600 m L粗酶液。取0.1 m L粗酶液與0.1 m L底物溶液相混合,50℃進(jìn)行酶解反應(yīng)8 h,然后加入0.2 m L的水飽和正丁醇終止酶反應(yīng),振蕩、分層,取上層液作TLC檢測,并測定其酶活力為696.6 U/m L。TLC結(jié)果如圖1所示,底物蘆丁轉(zhuǎn)化較徹底,轉(zhuǎn)化率達(dá)到了95%以上。

利用此酶進(jìn)行底物蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)。準(zhǔn)確稱量24.0 g蘆丁,加入480 m L 0.02 mol/L pH 5.0的 HAc-Na Ac緩沖溶液和120 m L 95%的乙醇,然后加入600 m L酶液,混入恒溫50℃的反應(yīng)釜中,攪拌反應(yīng)8 h后終止酶反應(yīng)。將反應(yīng)液在7 000 r/min下高速冷凍離心10 min,然后對上清液進(jìn)行濃縮、干燥,得到粗產(chǎn)品質(zhì)量為26.5 g。產(chǎn)物量比投料量大的主要原因是,在酶反應(yīng)的過程中有少量的糖類、蛋白質(zhì)以及色素等雜質(zhì)生成?；厥沾置敢涸倥c24.0 g蘆丁進(jìn)行酶反應(yīng),重復(fù)進(jìn)行5次,120.0 g的蘆丁經(jīng)酶轉(zhuǎn)化得到粗產(chǎn)品128.5 g。

圖1 蘆丁-α-鼠李糖苷酶粗酶水解蘆丁的TLC圖譜Fig.1 TLC of rutin-α-rhamnosidase hydrolysis

2.2 產(chǎn)物的異槲皮苷分離純化

取24.0 g蘆丁酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的粗品,采用硅膠柱柱層層析法對其進(jìn)行分離純化,洗脫梯度為V(氯仿)∶V(甲醇)＝9.2∶0.8,每次收集250 m L,共洗脫35瓶,用薄層層析板點(diǎn)樣跟蹤,根據(jù)TLC結(jié)果,將相同組分合并收集并濃縮干燥。其中單點(diǎn)異槲皮苷部分質(zhì)量為13.1 g,異槲皮苷的得率為49.4%,其TLC圖見圖2,其中第12～26瓶在板上顯示為單點(diǎn)。

圖2 硅膠分離產(chǎn)物的TLC圖譜Fig.2 TLC result of separation by silica gel

2.3 高效液相色譜測定純度

經(jīng)硅膠柱分離得到的異槲皮苷單體,利用高效液相色譜對其進(jìn)行純度鑒定。取1.0 mg的樣品,用甲醇定容于10 mL的容量瓶中,進(jìn)樣量為10μL,測定結(jié)果顯示純度為98.3%,HPLC結(jié)果見圖3。

圖3 異槲皮苷HPLC色譜圖Fig.3 HPLC of isoquercitrin

3 結(jié) 論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,利用Absidiasp.R9g菌產(chǎn)的蘆丁-α-鼠李糖苷酶粗酶液,轉(zhuǎn)化蘆丁生成異槲皮苷的效果較為理想,反應(yīng)時間短,轉(zhuǎn)化率達(dá)到了95%以上,該酶液可反復(fù)回收利用多次,且酶活損失少。該法較傳統(tǒng)的化學(xué)法有更多優(yōu)勢,不僅反應(yīng)條件溫和,對底物的選擇性強(qiáng),而且反應(yīng)過程容易控制?？傊?可以通過酶法簡單方便地制備產(chǎn)物異槲皮苷,為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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(WANG Kan,YU Hong-shan,JIN Feng-xie.Purification and characterization of rutin-α-rhanmosidase[J].Journal of Dalian Institute of Light Industry,2004,23(1)：30-33.)

The enzymatic transformation of rutin and the separation of the hydrolysate isoquercitrin

WU Di,LIU Ting-qiang,WANG Dong-ming,JIN Feng-xie,YU Hong-shan
(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

Isoquercitrin was transformation from rutin by rutin-α-rhamnosidase(RhaR)produced with Absidia sp.R9g.Hydrolysate was separated from 24.0 g rutin by silica gel column and 13.1 g isoquercitrin was obtained.The yield was 49.4%and the purity of the product was 98.3%.

rutin-α-rhamnosidase；enzymatic transformation；isoquercitrin

Q556.2；Q946.83

A

1674-1404(2012)06-0399-03

2011-11-11.

遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2009T007).

吳 迪(1987-),女,碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-),男,教授.